شکل ۱-۲: ساختار مولکولی ۴ گروه مهم از فلاونوئیدها ۱۱
نمودارها
نمودار ۳-۱: محتوای فنل کل (mgGAE/100GFW) بخش‌های مختلف ۲۷
نمودار ۳-۲: محتوای فلاونوئیدی کل (mgQE/100GFW) بخش‌های مختلف ۳۰
نمودار ۳-۳: درصد ظرفیت جاروب کنندگی رادیکال‌های آزاد DPPH بخش‌های مختلف ۳۱
نمودار ۳-۴: قدرت احیا (جذب در ۵۹۵ نانومتر) بخش‌های مختلف ۳۴
نمودار ۳-۵: فعالیت شکستگی زنجیر بخش‌های مختلف مختلف ۳۶
نمودار ۳-۶: درصد مهار رادیکال نیتریک اکسید بخش‌های مختلف مختلف ۳۷
نمودار ۳-۷: پراکسیداسیون چربی بخش‌های مختلف مختلف ۴۰
نمودار ۳-۸: درصد مهار رادیکال سوپراکسید بخش‌های مختلف مختلف ۴۱
نمودار ۴-۱: منحنی استاندارد گالیک اسید ۴۵
نمودار ۴-۲: منحنی استاندارد کوئرستین ۴۵
نمودار ۴-۳: منحنی استاندارد FESO₄ برای آزمایش FRAP 46

چکیده
انگور (Vitis vinifera L.) به خانواده‌ی Vitaceae تعلق دارد که حاوی عناصر غذایی مختلف از جمله ویتامین‌ها، مواد معدنی، کربوهیدرات‌ها، فیبرها، اسیدهای آلی و اسیدهای فنولیک می‌باشد که برای آن خواص درمانی فراوانی از جمله ضد سرطان، ضد التهاب و خواص ضد میکروبی ذکر کرده‌اند. رادیکال‌های آزاد به عنوان عامل اصلی انواع مختلف بیماری‌های مزمن و تخریب کننده شناخته شده‌اند. ترکیبات فنولی دارای فعالیت پاداکسایشی زیادی می‌باشند که اکسیداسیون ترکیبات زیستی ضروری را مهار می‌کنند. در این مطالعه انگور رقم کشمشی قرمز از روستای امامزاده شهر ارومیه جمع آوری شدند. استخراج ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی، از برگ، میوه نارس، میوه رسیده و میوه خشک شده توسط دو حلال اتانول و متانول انجام شدند. محتوای کل ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی با بهره گرفتن از روش اسپکتروفتومتری بررسی شد. میزان توانایی آنتی اکسیدانی عصاره‌ها با بهره گرفتن از روش‌های DPPH ، فعالیت شکستگی زنجیر، سوپراکسید و نیتریک اکسید تعیین شد. میزان قدرت احیاء عصاره‌ها توسط آزمون FRAP و توانایی مهار پراکسیداسیون لیپیدها با روش TBA اندازه‌گیری شد. نتایج نشان داد که از بین اندام‌های مختلف انگور، کشمش در حلال اتانولی بیشترین ترکیبات فنولی و در حلال متانولی بیشترین ترکیبات فلاونوئید را دارا بود. بالاترین میزان درصد جمع آوری رادیکال DPPH و میزان پراکسیداسیون چربی مربوط به عصاره اتانولی برگ بود. بیشترین درصد مهار رادیکال نیتریک اکسید در عصاره متانولی برگ مشاهده شد. بیشترین فعالیت شکستگی زنجیر و درصد مهارکنندگی رادیکال سوپراکسید در عصاره متانولی غوره مشاهده شد. بیشترین قدرت احیاء در عصاره اتانولی غوره مشاهده شد. بررسی نتایج نشان داد که در فرایند استخراج و عصاره‌گیری، اتانول بهتر از متانول عمل کرده است. بنابراین بخش‌های مختلف میوه انگور، به عنوان یک منبع غنی از پاداکساینده‌های طبیعی است.
کلمات کلیدی : ترکیبات فنولی، فعالیت پاداکسایشی، انگور کشمشی قرمز
فصل اول
کلیات
۱- مطالعات بیوشیمیایی (آشنایی با پاداکساینده‌ها)
۱-۱- مطالعات بیوشیمیایی
۱-۲- رادیکال‌های آزاد
هر گونه مولکولی دارای یک الکترون جفت نشده در اوربیتال اتمی باشد به عنوان رادیکال آزاد شناخته می‌شود. تولید رادیکال‌های آزاد در سیستم‌های، با آسیب متابولیکی و سلولی، پیر شدن سریع، سرطان، بیماری‌های قلبی-عروقی، بیماری‌های تخریب سیستم عصبی و التهاب همراه است. بسیاری از رادیکال‌های آزاد به شدت واکنش‌پذیر هستند و می‌توانند یک الکترون را از مولکول‌های دیگر بگیرند یا به مولکول‌های دیگر بدهند. بنابراین رفتار آنها بصورت اکساینده یا احیاکننده در نتیجه‌ی این واکنش‌پذیری بالا است. اگرچه در سیستم‌های بیولوژیکی بسیاری از رادیکال‌های آزاد دارای دوره‌ی عمر طولانی هستند، اما اکثر رادیکال‌های آزاد دوره‌ی عمر کوتاهی دارند (Young et al., ۲۰۰۱). رادیکال‌های آزاد در طول فرایند اکسیداسیون در سیستم‌های زیستی تشکیل می‌شوند و باعث پراکسیداسیون مواد از جمله لیپیدها و تشکیل موادی از جمله مالون دی آلدهید می‌شوند که در نتیجه‌ی آن ساختار غشایی آسیب‌پذیر می‌شود و باعث از بین رفتن سلول می‌شود که در این گونه موارد ضداکساینده‌ها نقش حفاظت‌ کننده دارند. ضداکساینده‌های مصنوعی سنتز شده نیز به هر حال می‌توانند منجر به ایجاد عوارض خاصی در سیستم‌های زیستی شوند، بنابراین تلاش محققان برای کشف و استفاده از ضداکساینده‌های طبیعی موجود در میوه‌ها و سبزی‌ها افزایش یافته است (Senevirathne et al., ۲۰۰۶). رادیکال‌های آزاد، مولکولهای ناپایدار و بسیار واکنش‌پذیری هستند که شامل گونه‌های فعال اکسیژن(^[۱]ROS) و گونه‌های فعال نیتروژن (RNS^[2]) هستند که شامل رادیکال‌های آزاد مثل آنیون سوپراکسید، هیدروکسیل و رادیکال اکسید نیتریک و نیز گونه‌های غیر رادیکال آزاد مثل پراکسیدهیدروژن و اسید نیتروز(HNO3) می‌باشند (Halliwel et al.,1995). زمانی که سازوکارهای ضداکسایشی طبیعی غیر موثر می‌شوند، دریافت ترکیبات ضداکساینده از طریق رژیم غذایی، داروهای مصنوعی یا داروهای گیاهی ضرورت پیدا می‌کند. بهترین راه مقابله در مقابل رادیکال‌های آزاد مصرف کافی مواد پاداکساینده مثل ویتامین E و ویتامین C است (شکل۱-۱). مطالعات اخیر نشان می‌دهد که مصرف میوه‌ها و سبزیجات با کاهش خطر بروز بیماری‌های مزمن مثل بیماری‌های قلبی، سرطان بیماری‌های سیستم عصبی از جمله پارکینسون و آلزایمر، التهاب و پیری پوست همراه می‌باشد (Nychas et al., ۱۹۹۵). بطور کلی، رادیکال‌های آزاد به وسیله شکستگی یک پیوند در یک مولکول پایدار و به وجود آمدن دو قطعه، که هر یک از آن‌ها حاوی یک الکترون جفت نشده است تشکیل می‌شوند (Karlsson and Alexandria, 1997). این ترکیبات مولکول‌های فعال شده‌ای هستند که به طور طبیعی در سلول‌های بدن تولید می‌شوند، لیکن تولید آن‌ها ممکن است تحت شرایط خاص مانند بیماری یا در پاسخ به صدمات خارجی افزایش یابد (Visioli, 1997).

شکل ۱-۱- ویتامین‌ها و مقابله با رادیکالهای آزاد
۱-۲-۱- انواع رادیکال‌های آزاد
۱-۲-۱-۱- هیدروژن پراکسید
هیدروژن پراکسید (H₂O₂) خود یک رادیکال نیست، اما جز ROSها محسوب می‌شود. خاصیت مهم زیستی آن این است که بصورت آزادانه از غشا عبور می‌کند که سوپراکسید این خاصیت را ندارد (Young et al., ۲۰۰۱).
۱-۲-۱-۲- رادیکال هیدروکسیل
رادیکال هیدروکسیل (OH˚) یا گونه‌های مرتبط با آن احتمالاً واسطه‌های نهایی اکثر رادیکال‌های آزاد هستند. سوپر اکسید و هیدروژن پر اکسید می‌توانند بطور مستقیم برای تولید رادیکال هیدروکسیل با هم واکنش دهند، اما سرعت ثابت برای انجام این واکنش در محلول آبی صفر است. ولی اگر فلزات واسطه حضور داشته باشند واکنش می‌تواند در سرعت بالایی پیش رود Young et al., ۲۰۰۱)).
Fe^2+. + O₂^- Fe²⁺ + O₂
Fe²⁺ + H₂O₂ Fe²⁺ + OH + OH^-
Net result:
O^2- + H₂O₂ OH^- + OH + O₂
۱-۲-۱-۳- رادیکال نیتریک اکسید
این رادیکال دارای فعالیت دوگانه است یعنی هم به عنوان ضداکساینده و هم به عنوان اکساینده عمل می‌کند. این نقش دوگانه نیتریک اکسید بستگی به غلظت آن در محیط دارد. توانایی این رادیکال در به‌کارگیری عملکرد حفاظتی در برابر تنش اکسایشی به وسیله‌ی عوامل زیر ایجاد می‌شود:
۱- نیتریک اکسید با رادیکال‌های چربی واکنش داده و از طریق انتشار اکسیداسیون را متوقف می‌کند.
۲- نیتریک اکسید باعث فعال‌سازی آنزیم‌های پاد اکسایشی (کاتالاز، سوپراکسید دیسموتازو پراکسیداز) می‌شود.
۳- نیتریک اکسید باعث جاروب کردن رادیکال‌های آنیون سوپر اکسید و تشکیل پر اکسی نیتریت (Peroxynitrie) (ONOO˚) شده که این ماده یک اکساینده‌ی قوی است، اما به‌وسیله آسکوربات و گلوتاتیون خنثی می‌شود.
نقش اکسایشی آن به این صورت است که واکنش نیتریک اکسید ((NO^˚ با آنیون سوپر اکسید (O₂^-) منجر به تشکیل اکسنده‌ی قوی پراکسی نیتریت (ONOO˚) می‌شود که اثرات زیان‌باری بر روی پروتیین، چربی‌ها و لیپیدها دارد که در pH فیزیولوژیک پراکسی نیتریت در تعادل با ONOOH است که به سرعت به NO₂ و OH˚ تجزیه می‌شود (Cooper et al., ۱۹۹۴).
۱-۲-۱-۴- اکسیژن منفرد
امروزه ثابت شده است که اکسیژن منفرد (O^-) می‌تواند با بسیاری از مولکول‌های زیستی مثل پروتیین‌ها، چربی‌ها و DNA واکنش دهد. در واکنش‌های O^- اغلب پیوندهای دو گانه کربن- کربن که در بسیاری از مولکول‌های بیولوژیکی مثل کاروتن، کلروفیلb و اسیدهای چرب غیراشباع وجود دارد، درگیر می‌باشند. طی این واکنش oxetane تشکیل می‌شود که به صورت ناپایدار است و به ترکیبات کربونیلی تجزیه می‌شود (Zhao, 2001).
۱-۲-۱-۵- رادیکال سوپراکسید
رادیکال سوپراکسید(O₂^-) با اضافه شدن یک الکترون به اکسیژن ایجاد می‌شود. فعالیت آنزیم‌های گوناگون مانند آنزیم‌های درگیر در سنتز هورمون آدرنالین و سیتوکروم اکسیداز در کبد منجر به جریانی از الکترون‌ها به داخل فضای سیتوپلاسم و افزایش تشکیل سوپر اکسید می‌شود. مولکولهای مختلفی مانند آدرنالین، نوکلئوتید فلاوین، ترکیبات دارای گروه تیول و گلوکز در حضور اکسیژن یونیزه شده و منجر به تولید سوپر اکسید می‌شوند (Whitehead et al., 1983) از مواد پاد اکسایشی این رادیکالهای آزاد می‌توان به ویتامین ث، گلوتاتیون، فلاوونوئیدها و سوپر اکسید دیسموتاز اشاره کرد (Percival, 1998).
غشاهای زیستی از محتوای فسفولیپید به همراه نسبت بالای اسیدهای چرب غیراشباع برخودارند و از این رو به فشار اکسایشی بسیار حساسند و به شدت به واکنش‌های زنجیره‌ای کمک می‌کنند. از دیگر اجزای سلول که رادیکال آزاد باعث تخریب در آنها می‌شوند، می‌توان به تخریب DNA و RNA سلول (به‌ویژه DNA موجود در میتوکندری)، آنزیم‌های پروتئینی فعال و غیر فعال در سلول، پروتئین‌های ساختاری و لیزوزوم‌ها اشاره کردBaea and Suh, 2007) ). تولید رادیکال‌های آزاد در سیستم‌های زنده، با آسیب متابولیکی و سلولی، پیر شدن سریع، سرطان، بیماری‌های قلبی-عروقی، بیماری‌های تخریب سیستم عصبی و التهاب همراه است (Ames et al., ۱۹۹۳). رادیکال‌های آزاد موجب پراکسیداسیون لیپیدی در غذاها نیز می‌شوند در نتیجه باعث تخریب و فساد آن‌ها می‌گردند. ROS و RNS می‌توانند موجب تغییر در بیان ژن‌ها و القای پروتئین‌های غیر طبیعی نیز گردند (Pada et al., ۲۰۰۶).
آسیب به غشای فسفولیپیدی سلول موجب پر اکسیداسیون لیپیدهای غشا و سخت شدن دیواره سلول‌ها می‌شود. در این صورت سلول نمی‌تواند به صورت مناسب مواد غذایی مورد نیاز و نیز سیگنال‌هایی که از دیگر سلول‌ها برای اجرای یک عمل صادر می‌شود(نظیر تکانه‌های عصبی) را دریافت کند و بدین ترتیب بسیاری از فعالیت‌های سلول تحت تاثیر قرار می‌گیرد. این موضوع حتی می‌تواند به بیماری پارکینسون منجر شود (Ames et al., ۱۹۹۳).
اولین جایی که به وسیله رادیکال آزاد تخریب می‌شود، DNA میتوکندری (جایی که اکثر رادیکال‌های آزاد تولید می‌شوند) است. DNA موجود در قسمت‌های دیگر سلول نیز ممکن است به وسیله رادیکال‌های آزاد آسیب ببینند. از آنجایی که DNA مواد ژنتیکی سلول‌هاست، آسیب به آنها ممکن است باعث مرگ و یا جهش در آنها شده و آن‌ها را سرطانی کند. از این رو رادیکال‌های آزاد ممکن است موجب سرطان‌های ریه، پوست، معده، پروستات و… شوند (Ames et al., ۱۹۹۳).