Water 11 µl
Total 20 µl
سپس پروتکل دمایی طبق برنامه ی زیر دنبال شد
-زمان و دمای فعال سازی آنزیم و نیز واسرشتی^[۷۱] اول ده دقیقه در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد
-زمان و دمای واسرشتی هرسیکل ۱۵ ثانیه در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد
-زمان و دمای اتصال پرایمر^[۷۲] و امتداد رشته هر سیکل و نیز خوانش فلورسنت ساطع شده در پایان هر سیکل ۶۰ ثانیه در دمای ۶۰ درجه سانتیگراد
کل واکنش در ۴۰ چرخه تکرار شد و برای هر گروه آزمایشی سه تکرار مختلف و به صورت دوتایی انجام شد. آنالیز داده ها توسط نرم افزار ۷۰۰۰ Applied Biosystem SDS انجام شد و محاسبات لازم با روش CTΔΔ صورت گرفت.

۲-۸-۹-۲-بررسی کمی بیان ژن با بهره گرفتن از روش Real-Time PCR
Real-Time PCR از مولکول های گزارشگر فلورسنت برای نمایش کمی تولید محصولات تکثیر شده در طول هر سیکل واکنش PCR استفاده می کند. مقدار فلورسنت منتشر شده مستقیما به مقدار محصول تولید شده در هر سیکل PCR نسبت داده می شود، بنابراین می تواند به عنوان یک سنجش کمی از واکنش PCR به کار رود. در این مطالعه ژن های هدف به وسیله ژن مرجع GAPDH نرمال شده است. بیان نسبی ژن ها در مقایسه بین گروه های آزمایشی توسط روش ∆CT و محاسبه ۲-∆∆CT انجام شد. CT عبارت است از اولین افزایش معنی دار در محصول PCR که به آن سیکل آستانه^[۷۳] گفته می شود. به طور خلاصه محاسبات به این صورت انجام شد که ابتدا CT ژن هدف در هر مرحله از CT ژن رفرنس (GAPDH) در همان مرحله کسر شد و ∆CT بدست آمد. سپس ∆CT همه نمونه ها برای ژن های مختلف از ∆CT مرحله صفر (گروه کنترل) کسر شده و ∆∆CT برای هر نمونه حاصل گردید. در نهایت مقادیر ۲-∆∆CT محاسبه گردید.
۲-۹-آنالیز آماری داده ها
به منظور بررسی اثرات انجماد و زمان بر پارامتر های مورد بررسی (میزان بقای سلولی، آپوپتوز سلولی و میزان بیان رونوشت ژن های دخیل در آپوپتوز) از تحلیل واریانس اندازه های تکراری^[۷۴]، تحلیل واریانس یک طرفه^[۷۵] و آزمون تعقیبی توکی^[۷۶] استفاده شد. برای تجزیه و تحلیل کلیه ی داده ها از نرم افزار SPSS16 استفاده شد و سطح معنا داری ۰۵/۰ در نظر گرفته شد (P<0.05).
فصل سوم
نتایج
۳-۱-بررسی کیفی مورفولوژی بافت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین
به منظور بررسی مورفولوژی بافت بیضه در هر یک از گروه های کنترل ، انجمادی I و II، ۳ بیضه در ۳ تکرار مستقل پس از رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین مورد بررسی کیفی قرار گرفتند. یکپارچگی بافت بیضه بلافاصله پس از ذوب (ساعت صفرکشت) در گروه انجمادی I تقریبا مشابه با گروه کنترل بود، در حالی که در گروه انجمادی II در مقایسه با گروه کنترل، یکپارچگی بافت بیضه کمتر حفظ شده بود و از هم گسیختگی بافت بینابینی بیشتر مشهود بود. در هر دو گروه انجمادی، سلولهای دارای هسته پیکنوزه در تعدادی از لوله های سمی نفروس مشاهده شد و در گروه انجمادی II، در تعدادی از لوله های منی ساز پارگی و جداشدگی از غشا پایه نیز مشهود بود (شکل ۳-۵). در ساعت ۳ پس از کشت تعداد سلول های پیکنوزه در نواحی مختلف بافت خصوصا در نواحی مرکزی در گروه های انجمادی افزایش یافته بود (شکل ۳-۶) و در ساعت ۲۰ پس از کشت، نواحی مرکزی قطعات بیضه کشت داده شده در گروه کنترل و هر دو گروه انجمادی دچار تخریب شده بودند، که این میزان در گروه کنترل نسبت به گروه های انجمادی از وسعت کمتری برخوردار بود. با این وجود نمای لوله های سمی نفروس محیطی در تمامی گروه ها خصوصا در گروه کنترل تقریبا طبیعی به نظر می رسید (شکل ۳-۷).
۳-۲-مقایسه بقای سلولی در گروه کنترل با گروه های انجمادی I و II بلافاصله پس از ذوب
درصد بقای سلولی بلافاصله پس از ذوب در گروه انجمادی II در مقایسه با گروه انجمادی I و گروه کنترل (به ترتیب ±۲/۰۸۰۲/۵۶ در برابر ۷۷/۵۵±۲/۶۶و۸۲/۶۰±۲/۰۲ ) به طور معناداری (P<0/05) پایین تر بود، این درصد در گروه کنترل و انجمادی I تفاوت معنی داری را نشان نداد (جدول ۳-۱).
۳-۳ بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه
ارزیابی میزان بقای سلولی، آپوپتوز اولیه و ثانویه ی سلولی و همچنین نکروز بافتی طی دوره ی کشت در گروه های کنترل، انجمادی I و انجمادیII در پنج تکرار مستقل انجام شد.
۳-۳-۱-ارزیابی میزان بقای سلولی طی کشت بافت بیضه
در کل میزان بقای سلولی در گروه های انجمادی، بلافاصله پس از ذوب و همچنین طی دوره ی کشت بافت بیضه در مقایسه با گروه کنترل به طور معناداری (P<0/05) پایین بود. این درصد در گروه انجمادیI در زمان صفر و سه به طور معناداری (P<0/05) بالاتر از گروه انجمادی II بود; ولی در ساعت ۲۰ کشت میزان بقا در هر دو گروه انجمادی تقریبا مشابه یکدیگر شدند. در کل دوره ی کشت نیز کاهش معناداری (P<0/05) در میزان بقای سلولی در کلیه ی گروه های مورد مطالعه دیده شد (جدول ۳-۲).
۳-۳-۲-آپوپتوز اولیه ی سلولی^[۷۷] طی کشت بافت بیضه
به طور کلی درصد سلول هایی که بلافاصله پس از ذوب (ساعت صفر) دچار آپوپتوز اولیه شده بودند در گروه انجمادیI در مقایسه با گروه های کنترل و انجمادیII (بترتیب ۳۷/۳۴±۰/۹۱ در برابر ۴/۶۵±۰/۳۷ و ۳۰/۷۲±۲/۲۰) به طور معناداری (P<0/05) بالاتر بود، این در حالی بود که این میزان در گروه کنترل در مقایسه با سایر گروه ها پایین ترین حد را داشت. ۳ ساعت ابتدایی کشت سبب کاهش درصد آپوپتوز اولیه سلولی در گروه های انجمادی شد اما این درصد ها بین گروه های مختلف تفاوت معناداری نداشت. ۲۰ساعت کشت نیز سبب کاهش درصد سلول هایی که دچار آپوپتوز اولیه ی سلولی شده بودند در گروه های انجمادی شد و نکته جالب توجه آنکه این درصد در گروه کنترل در مقایسه با گروه های انجمادی به طور چشم گیری (P<0/05) بالاتر بود. درکل در طی دوره ی کشت ۲۰ ساعته، درصد سلول هایی که دچار آپوپتوز اولیه ی سلولی شده بودند به طور چشم گیری (P<0/05) در هر دو گروه انجمادی کاهش یافت، اما در گروه کنترل درصد سلول های آغاز کننده ی آپوپتوز در ساعت ۳ و ۲۰ پس از کشت در مقایسه با ساعت صفر (بترتیب ۸/۴۰±۱/۱۵ و ۶/۶۱±۰/۲۲ در برابر۴/۶۵±۰/۳۷) افزایش معناداری داشتند (P<0/05) (جدول ۳-۳).
۳-۳-۳ آپوپتوز ثانویه ی سلولی^[۷۸] طی کشت بافت بیضه
در­­­­­­­­­­­­صد سلول هایی که دچار آپوپتوز ثانویه شدند در ساعت صفر و ۳ کشت در هر دو گروه انجمادی نسبت به گروه کنترل به طور معنا داری (P<0/05) بالاتر بود. این درصد ۲۰ ساعت پس از کشت در گروه انجمادی IIدر مقایسه با گروه کنترل (به ترتیب ۲۴/۷۱±۱/۳۶ و(۳۱/۸۶±۱/۰۸ کاهش معناداری (P<0/05) نشان داد، در حالی که گروه انجمادی I درصدی مشابه گروه کنترل داشت. در واقع درصد سلول هایی که دچار آپوپتوز ثانویه شده بودند در طی مدت زمان کشت در گروه کنترل و گروه انجمادی I افزایش معناداری (P<0/05) یافت. این در حالی بود که در گروه انجمادی II، میزان مرگ سلولی در ساعت ۳ پس از کشت افزایش معناداری نسبت به زمان صفر و ۲۰ پس از کشت (به ترتیب ۵۱/۱۷±۱/۴۵ در برابر ۲۴/۸۳±۱/۰۷ و ۲۴/۷۱±۱/۳۶) داشت (جدول ۳-۴).
۳-۳-۴ نکروز^[۷۹] بافتی طی کشت بافت بیضه
درصد سلول هایی که دچار نکروز شده بودند، در ساعت صفر در گروه انجمادی IIدر مقایسه با گروه انجمادیI (بترتیب ۱۴/۷۸±۲/۳۷ و ۷/۵۷±۰/۷۴) به طور معناداری (P<0/05) بالاتر بود. ۳ ساعت پس از کشت، این درصد در گروه انجمادی I درمقایسه با گروه های کنترل و انجمادی II ]بترتیب (۳۹/۰۷±۳/۰۶ در برابر ۷/۴۸±۱/۴۱ و ۲۱/۴۵±۲/۰۷) و در گروه انجمادی II در مقایسه با گروه انجمادی I ( 63/86±۱/۳۳در برابر ۱۴/۷۰±۱/۷۴ و ۵۰/۱۱±۳/۶۲)[ به طور معنا­داری (P<0/05) بالاتر بود. در طی مدت زمان کشت درصد سلول های نکروتیک در گروه های انجمادی افزایش معناداری داشت (P<0/05) (جدول ۳-۵).
۳-۴-بررسی بیان ژن های آپوپتوزی در سطح رونوشت
۳-۴-۱ -بررسی بیان رونوشت ژن های دخیل در مسیر های آپوپتوزی
پیش از بررسی میزان بیان رونوشت ژن ها در گروه های آزمایشی مختلف، طول محصول حاصل از Real time PCR که نشان دهنده اختصاصی بودن پرایمر است بر روی ژل الکتروفورز برای هر یک از ژن های مد نظر مورد بررسی قرار گرفت.
۳-۴-۲-Bax
میزان بیان ژن Bax در گروه انجمادی II در ساعت صفر کشت تقریبا با گروه کنترل مشابه بود، در حالی که در گروه انجمادی I افزایش معنا داری (P<0/05) در میزان بیان این ژن در مقایسه با گروه کنترل مشاهده شد. در ساعت۳ پس از کشت، بیان ژن Bax در گروه های انجمادی در مقایسه با گروه کنترل به طور معناداری (P<0/05) بالاتر بود و ۲۰ ساعت پس از کشت این میزان در گروه انجمادی I در مقایسه با گروه کنترل و انجمادی II به طور معنا داری (P<0/05) افزایش داشت.
در طی زمان کشت در گروه انجمادی I میزان بیان این ژن ۲۰ ساعت پس از کشت افزایش معناداری (P<0/05) را در مقایسه با دیگر زمان ها نشان داد، این در حالی بود که میزان بیان این ژن در ساعت ۳ کشت به کمترین میزان خود در مقایسه با دیگر ساعات رسید. در مورد گروه انجمادی II، تفاوت معناداری در الگوی بیانی ژن در زمان های مختلف کشت مشاهده نشد(جدول ۳-۶).
۳-۴-۳-BCL2
روند تغییر بیان رونوشت ژن ۲Bcl در گروه های کنترل و انجمادی تقریبا دارای الگوی مشابهی بود. میزان بیان این ژن ۲Bcl در هر دو گروه انجمادی و در همه ی زمان ها در مقایسه با گروه کنترل به طور معناداری (P<0/05) پایین تر بود. در هر دو گروه انجمادی الگوی بیان این ژن پس از انجماد و طی زمان های مختلف کشت تغییر معنا داری را نشان نداد (جدول ۳-۷)
۳-۴-۴-نسبت بیان BAX به BCL2
نسبت بیان BAX به BCL2 در زمان صفر و در گروه های انجمادی در مقایسه با گروه کنترل به طور معناداری (P<0/05) بالاتر بود اما در ساعت ۲۰ پس از کشت، گروه انجمادی I در مقایسه با گروه انجمادی II و کنترل افزایش معناداری (P<0/05) در نسبت بیان BAX به BCL2 مشاهده شد. در طی دوره ی کشت حداکثر نسبت بیان BAX به BCL2 در ساعت ۲۰ پس از کشت مشاهده شد (P<0/05). (جدول ۳-۸)
۳-۴-۵-Caspase3
طی دوره ی کشت، در تمامی زمان های مورد مطالعه میزان بیان ژن Caspase3 در گروه انجمادی Iدر مقایسه با گروه کنترل و گروه انجمادی II به صورت معناداری بالاتر بود (P<0/05). بالاترین میزان بیان این ژن در کلیه ی گروه ها در ساعت صفر کشت مشاهده شد، در حالی که در ساعت ۳ و ۲۰ کشت در گروه های مختلف تغییر معناداری در بیان این ژن مشاهده نشد (جدول ۳-۹).
۳-۴-۶-Fas
میزان بیان ژن Fas در ساعت صفر کشت در گروه انجمادیI در مقایسه با گروه کنترل و گروه انجمادی II افزایش معناداری (P<0/05) را نشان داد. در ۳ ساعت پس از کشت میزان بیان این ژن در گروه های انجمادی در مقایسه با گروه کنترل افزایش معناداری (P<0/05) را نشان داد، اما پس از ۲۰ ساعت کشت، این میزان بیان در گروه کنترل به طور معنا داری (P<0/05) بالاتر از گروه های انجمادی بود (جدول ۳-۱۰).
۳-۴-۷-Fas Ligand
در ساعت صفر کشت میزان بیان ژن Fas Ligand در گروه انجمادی II در مقایسه با گروه انجمادی I و گروه کنترل افزایش معنا داری (P<0/05) را نشان داد در حالی که پس از ۳ ساعت کشت، میزان بیان این ژن در گروه انجمادی I در مقایسه با گروه انجمادی II و گروه کنترل به طور معنا داری (P<0/05) بالاتر بود. در ساعت ۲۰ کشت، میزان بیان این ژن در هر دو گروه انجمادی در مقایسه با گروه کنترل به طور معناداری (P<0/05) بالاتر بود.
در گروه انجمادی I حداکثر میزان بیان ژن Fas Ligand در ساعت ۳ کشت مشاهده شد در حالی که کمترین میزان بیان آن در ساعت صفر رخ داد. میزان بیان ژن Fas Ligand در گروه انجمادی II در ساعت ۳ و ۲۰ پس از کشت به طور معناداری (P<0/05) بالاتر از زمان صفر بود (جدول ۳-۱۱).
۳-۴-۸-P53
در ساعت صفر کشت بیان ژنP53 در گروه انجمادی I در مقایسه با گروه کنترل به طور معناداری (P<0/05) کاهش بیان را نشان داد در حالی که نسبت به گروه انجمادیII افزایش داشت. در ساعت ۳ پس از کشت تفاوت معناداری بین گروه های مختلف مشاهده نشد. در طول دوره ی کشت در گروه انجمادی I کاهش معنا دار (P<0/05) بیان ژن P53 پس از ۲۰ ساعت کشت مشاهده شد، در حالی که در گروه انجمادی II تغییر معنا داری در بیان این ژن در طی زمان کشت مشاهده نگردید. میزان بیان این ژن در گروه کنترل رفته رفته و با افزایش ساعات کشت به طور معناداری (P<0/05) کاهش پیدا کرد (جدول ۳-۱۲).
جداول
جدول ۳-۱. میانگین بقای سلولی در گروه های کنترل، انجمادی I و انجمادی II