El-shawarby (۱۹۸۶) در یک فرایند نیمه صنعتی از باگاس نیشکر برای تولید پروتئین تک یاخته استفاده کردند. میکروارگانیسم مورد استفاده در این فرایند تریکودرما ویریدی^[۶۴] بوده است. باگاس با بهره گرفتن از NaOH (۱%) به مدت ۸ ساعت پیش تیمار شد. مدت زمان تخمیر ۲۸ روز و میزان پروتئین حاصل ۲۸% گزارش شد ]۴۸[.

۲-۴-۲- تخمیر
به طور کلی تولید توده زیستی میکروبی از دو روش تخمیر حالت غوطه ور و یا تخمیر حالت جامد انجام می شود. انتخاب نوع روش تخمیر تا حد زیادی به نوع سوبسترا، محصولات و بازدهی بستگی دارد. پس از تخمیر، توده زیستی استخراج شده و به عنوان منبع پروتئین مورد استفاده قرار می گیرد یا تحت فرایند های پایین دستی قرار می گیرد ]۴۹,۲[.
۲-۴-۲-۱- تخمیر حالت غوطه ور
در این نوع از تخمیر، محیط کشت به صورت محلول، امولوسیون و یا سوسپانسیون درون محیط آبی قرار دارد و سوبسترا همیشه در مایعی که شامل مواد مغذی برای رشد است تخمیر می شود. در این حالت سوبسترا در بیورآکتوری نگه داشته می شود که بطور پیوسته، نیمه پیوسته و ناپیوسته کار می کند و زمانی که توده زیستی تولید شد با روش های گوناگون استخراج می شود. محصول به دست آمده فیلتر یا سانتریفیوژ شده و سپس خشک می شود. در تخمیر حالت غوطه ور اندازه گیری پارامترهای فرایند ساده تر بوده و میکروارگانیسم ها در محیط کشت به صورت یکنواخت توزیع می شوند. عدم وجود مشکل کمبود رطوبت به دلیل حجم بالای آب از مزایای این نوع تخمیر است. تخمیر حالت غوطه ور سرمایه بیشتر و هزینه عملیاتی بالاتری نسبت به تخمیر حالت جامد دارد، با این وجود دارای بازده پروتئینی پایین تری است. محیط کشت شامل چندین پارامتر مهندسی شامل هم زدن، اختلاط سیستم های چند فازی (گاز، مایع، جامد)، انتقال اکسیژن از حباب های گاز به فاز مایع برای استفاده میکروارگانیسم ها و انتقال حرارت از فاز مایع به محیط اطراف است. هوادهی یک عملیات بسیار مهم در کشت است. حرارت عموما در طول کشت تولید می شود و می توان بوسیله دستگاه های خنک کننده آن را خارج کرد ]۴۹[.
۲-۴-۲-۲- تخمیر حالت جامد
تخمیر حالت جامد به معنی رشد میکروارگانیسم ها بر روی سوبسترای جامد بدون حضور آب آزاد است. با این حال، سوبسترا باید دارای رطوبت کافی برای رشد میکروارگانیسم ها باشد. فعالیت آبی سوبسترا در این نوع تخمیر مهم است. درتخمیر حالت جامد آب بسیار کم است و میکروارگانیسم ها برخلاف تخمیر غوطه ور به طور نزدیک در تماس با اکسیژن موجود در هوا هستند. این نوع تخمیر آسان تر بوده و انرژی مورد نیاز کمتری در مقایسه با حالت غوطه ور می خواهد. حجم پایین آب موجود باعث کاهش فضای اشغال شده بوسیله بیورآکتور شده، بدون اینکه بازده محصول را کاهش دهد. هوادهی و همزدن راحت تر است. یکی از جنبه های منفی SSF کندتر بودن آن نسبت به تخمیر غوطه ور است. SSF از هزاران سال قبل برای آماده سازی غذاهای محلی در کشورهای شرقی و نان، ماست و پنیر در کشورهای غربی استفاده می شد. همچنین امروزه در تولید برخی محصولات کاربرد دارد. تخمیر حالت جامد در زمینه تولید آنزیم ها، آنتی بیوتیک ها، فعال کننده های سطحی و غیره کاربرد دارد. هم چنین برای تولید محصولات با ارزش افزوده از ضایعات استفاده می شود ]۵۱,۵۰[. عموماً این نوع تخمیر برای تولید غذاهای تخمیر شده نظیر محصولات لبنی، سس سویا و ذرت تخمیر شده استفاده می شود ]۵۲[.
به طورکلی چندین جنبه مهم باید در هر فرایند بیولوژیکی درSSF مورد توجه قرار گیرد. این موارد شامل انتخاب میکروارگانیسم و سوبسترای مناسب، بهینه کردن پارامترهای فرایند، ایزوله کردن و خالص سازی محصول است.
بسیاری از انواع میکروارگانیسم ها توانایی رشد بر سوبستراهای جامد را دارند بنابراین می توانند در تخمیر حالت جامد استفاده شوند. قارچ، مخمر، برخی از باکتری ها و ترکیب آن ها می توانند مورد استفاده قرار بگیرند اما تنها قارچ های رشته ای می توانند به طور قابل ملاحظه ای در حالت بدون آب رشد کنند. باکتری ها و مخمرها بر روی سوبستراهای جامد با سطح رطوبت ۷۰-۴۰ درصد رشد می کنند ]۵۲,۵۱[. بر مبنای تئوری و بر پایه فعالیت آبی، تنها قارچ ها و مخمرها میکروارگانیسم های مناسب برایSSF هستند. محیط کشت SSF برای باکتری مناسب نیست اما با این حال تحقیقاتی در این زمینه انجام گرفته است ]۵۰[.
بسیاری از سوبستراهای جامد می توانند برای SSF مورد استفاده قرار بگیرند که از جمله آن ها ضایعات کشاورزی می باشند. در بین این ضایعات مواد سلولزی هم می توانند مورد استفاده قرار گیرند بدون اینکه نیاز به فرایند های پیش تیمار هزینه بر داشته باشند. زیرا محصولات SSF محلول نیستند و آسان تر از محصولات تولید شده در تخمیر غوطه ور بازیابی می شوند ]۵۲[.
تخریب سوبسترا در تخمیر حالت جامد تنها متأثر از کیفیت نیست بلکه تحت تأثیر اندازه ذرات نیز هست. ذرات با اندازه کوچک تخلخل را کاهش داده و باعث پایین آمدن نفوذ گاز می شود. در حالی که ذرات بزرگ رطوبت کندتری جذب می کنند و کمتر متورم می شوند بنابراین با خشک شدن سریع باعث رشد بهینه میکروارگانیسم می شوند. با افزایش سایز ذرات سوبسترا، سطح قابل دسترس کاهش خواهد یافت که باعث پایین آمدن فعالیت هیدرولیتیکی شده که در نتیجه آن محدود شدن ارتباط با عناصر هیدرولیز کننده است ]۱۲[.
۲-۴-۳- جداسازی و فرایند های پایین دستی
بعد از تخمیر، توده سلولی تولید شده توسط فیلتراسیون یا سانتریفیوژ از محیط کشت مصرف شده جدا می شود و می تواند مستقیماً بعنوان یک منبع پروتئینی مصرف شوند و یا ممکن است تحت فرآیندهای دیگر مثل شستشو، شکستن سلول، استخراج پروتئین، خالص سازی و پاستوریزاسیون قرار گیرند و بعد از عملیات خشک شدن و بسته بندی به عنوان یک منبع پروتئینی مورد استفاده قرارگیرد ]۲[.
۲-۵- رآکتورهای مورد استفاده در تخمیر حالت جامد
انواع مختلف بیورآکتورها برای تخمیر حالت جامد مورد استفاده قرار می گیرند.Durand (۲۰۰۳) مروری را در مورد طراحی رآکتورها در تخمیر حالت جامد ارائه داده است ]۵۴[. به طور کلی چهار نوع رآکتور در فرآیندهای تخمیر حالت جامد مورد استفاده قرار می گیرند که شامل رآکتورهای سینی دار، آکنده، استوانه ای دوار و بستر سیال می باشد ]۵۵[.
۲-۵-۱- رآکتورهای سینی دار
رآکتورهای سینی دار ساده ترین رآکتورهای تخمیر حالت جامد برای کاربردهای تجاری محسوب می شوند. این رآکتورها معمولا شامل سینی های کم عمقی به همراه سوبستراهای تخمیری می باشند که توسط میکروارگانیسم ها تلقیح شده است (شکل۲-۶). سطح بالای سینی ها در معرض هوا قرار دارد. سطح پایینی معمولا سوراخ می شود. رطوبت با اسپری کردن آب یا محلول استریل شده به درون محفظه کنترل شده و بنابراین در یک سطح بهینه نگه داشته می شود. در کاربردهای صنعتی رایج تخمیر حالت جامد معمولاً از این نوع رآکتورها استفاده می کنند، چون این نوع رآکتور ساده ترین نوع رآکتور بوده و دانش ها و تجربیات فراوانی در این زمینه موجود است. می توان با اضافه کردن تعداد سینی ها، فرآیندهای تولید در مقیاس بالا را با این بیورآکتورها انجام داد. نمونه های تجاری بیورآکتورهای سینی دار را می توان در صنایع تولید پنیر و آنزیم ها (سلولاز و پروتئاز) مشاهده کرد. از مزایای این بیورآکتورها می توان به ساده بودن آن اشاره کرد و اینکه در طول فرایند نیاز به هیچ گونه کنترل دستی نمی باشد. مشکلاتی در این نوع رآکتورها وجود دارد که مهم ترین آن بالا بودن حرارت است. همچنین نبود اکسیژن کافی و غلظت بالای دی اکسید کربن از دیگر مشکلات آن است. این مشکلات بیشتر در لایه های زیرین سوبسترای روی سینی ها اتفاق می افتد که باعث مهار رشد میکروبی می شود. به همین دلیل گفته می شود که تولید محصول در لایه های سطحی سینی ها بیشتر رخ می دهد. حذف حرارت در سینی ها عمدتاً بستگی به هدایت از طریق دیواره های سینی ها به هوا دارد. مشکلات دیگر شامل خطر آلوده شدن و بازده پایین استفاده از سوبسترا که در نتیجه شارهای کم حرارتی و جرمی بوجود می آید می باشد. این بیورآکتورها می توانند بدون هوادهی اجباری باشند یا اینکه در آن ها از هوادهی اجباری استفاده شود ]۵۷,۵۶[.
شکل ۲-۶: شماتیکی از یک رآکتور سینی دار] ۵۵[
۲-۵-۲- رآکتورهای آکنده
یک بیورآکتور آکنده برای تخمیر حالت جامد، شامل ستونی با یک پایه سوراخدار به منظور هوادهی اجباری است. این بیورآکتور ممکن است دارای پوششی برای کنترل دما طی فرایند تخمیر باشد (شکل ۲-۷). در این رآکتورها چون هوا از میان بستر پمپاژ می شود، انتقال جرم جابجایی اجباری اتفاق میافتد. کاهش تخلخل بستر با گذشت زمان یکی از مشکلات این رآکتورهاست. کار کردن با این رآکتورها به عنوان رآکتورهای پیوسته مشکل است و با کیکی شدن بستر در ستون ها، سروکار داشتن با جامد دشوار می گردد ]۵۵[.
شکل ۲-۷: شماتیکی از یک رآکتور آکنده ]۵۵[
۲-۵-۳- رآکتورهای استوانه ای دوار
در رآکتورهای استوانه ای دوار، بستر سوبسترا در داخل یک لوله افقی و یا نزدیک به افقی قرار گرفته که می تواند به طور پیوسته یا پی در پی مخلوط شود (شکل ۲-۸). تأثیر شرایط عملیاتی خصوصاً سرعت چرخش توسط محققان بسیاری مورد مطالعه قرار گرفته است. Stuart و همکارانش (۱۹۹۹) نشان دادند که اندازه تأثیر برشی که در نتیجه چرخش لوله بوجود می آید بحث انگیز است. در برخی از مطالعات سرعت بالای چرخش باعث کاهش میزان تولید محصول شده است. در برخی دیگر از مطالعات بیشترین میزان محصول در بالاترین سرعت های چرخش به دست آمد. الگوی جریان گاز در این نوع رآکتورها موضوع قابل تأمل دیگری است که باعث گرادیان های دمایی چشم گیری در بستر سوبسترا می شود. افزایش مقیاس رآکتورهای استوانه ای دوار نیز با اندازه مخزن و طراحی مکانیکی محدود می شود ]۵۸[.

شکل ۲-۸: شماتیکی از یک رآکتور استوانه ای دوار ]۵۹[
۲-۵-۴- رآکتورهای بستر سیال
بسترهای سیال گاز-جامد برای بهبود انتقال حرارت و انتقال جرم در تخمیر حالت جامد مورد استفاده قرار می گیرند. در یک بستر سیال، سرعت جریان گاز مورد نیاز برای شناورسازی به منظور تأیید مناسب بودن سرعت انتقال جرم و حرارت به اندازه کافی بالا است (شکل ۲-۹). شناورسازی مستلزم استفاده از اجزای مناسب بوده و حداقل سرعت هوا به منظور شناورسازی بالا است که نیاز به انرژی زیادی به منظور تأمین آن می باشد. هم چنین استفاده از توان بالا باعث آسیب های برشی زیادی به میکروارگانیسم ها خصوصاً قارچ ها می شود. یک بستر شناور ممکن است انتقال حرارت و جرم خوبی را فراهم کند در حالیکه مستلزم سرعت جریان گاز کمی باشد ]۶۱,۶۰[.
شکل ۲-۹: شماتیکی از یک رآکتور بستر سیال ]۵۵[
پروتئین تک یاخته حاصل از توده های زیستی مانند ضایعات کشاورزی، پتانسیل زیادی برای جایگزینی پروتئین های گیاهی و حیوانی دارد. همانطور که گفته شد از میان ضایعات، مواد لیگنوسلولزی مانند کاه جو، تفاله نیشکر، ضایعات چغندر و غیره برای تولید پروتئین تک یاخته مورد استفاده قرار گرفته اند و پیش تیمارهای مختلفی برای این نوع از سوبستراها انجام گرفته است. اما بنابر مطالعات انجام شده بررسی های کمتری در زمینه تولید پروتئین تک یاخته از این مواد در تخمیر حالت جامد انجام شده است. بخش اعظم مطالعات در محیط کشت غوطه ور انجام گرفته است. تبدیل مواد لیگنوسلولزی به پروتئین تک یاخته و دیگر مواد تخمیری فواید اقتصادی و زیست محیطی به همراه خواهد داشت. موفقیت در تولید پروتئین تک یاخته با بهره گرفتن از توده های زیستی تا حد زیادی به خصوصیات فیزیکی و شیمیایی سوبسترا، روش های پیش تیماری، میکروارگانیسم مناسب و بهینه سازی شرایط عملیات بستگی دارد.باتوجه به اهمیت بیورآکتورها در فرآیندهای تخمیری و افزایش بازدهچنین فرآیندهایی، استفاده از آن ها بسیار مورد توجه بوده است. طبق بررسی های انجام گرفته تولید پروتئین تک یاخته از مواد لیگنوسلولزی در بیورآکتور سینی دار تاکنون انجام نگرفته است و بدین سبب این پروژه بر مبنای آن تعریف شده است.
فصل سوم
مواد و روش ها
۳-۱- مقدمه
در این فصل مواد و روش های مورد استفاده برای تولید پروتئین تک یاخته از باگاس نیشکر با بهره گرفتن از مخمر ساکرومایسیس سرویسیه ارائه می گردد. آزمایش های انجام گرفته برای بررسی اثر پارامترهای متعددی نظیر رطوبت اولیه سوبسترا، مدت زمان تخمیر، دما و رطوبت داخلی بیورآکتور، پیش تیمار ماده اولیه و منبع نیتروژنی مورد استفاده روی میزان تولید محصول به تفصیل توضیح داده خواهد شد. همچنین آنالیزهای انجام گرفته برای تعیین خصوصیات محصول از جمله سنجش پروتئین و اسیدهای آمینه ارائه می گردد.
۳-۲- مراحل انجام پروژه
مراحل انجام پروژه به صورت خلاصه در شکل ۳-۱ نمایش داده شده است:
تعیین خصوصیات سوبسترا و اندازه گیری ترکیبات لیگنوسلولزی آن
راه اندازی بیورآکتور سینی دار و آزمایش های تخمیر حالت جامد
بهینه کردن پارامترهای عملیاتی برای رسیدن به حداکثر تولید SCP و سنجش میزان پروتئین محصول
تولید SCP با بهره گرفتن از پارامترهای بهینه
انجام آزمایش آمینواسید به منظور ارزیابی ارزش تغذیه ای SCP
شکل ۳-۱: خلاصه ای از مراحل انجام پروژه
۳-۳- تجهیزات مورد استفاده
دستگاه ها و تجهیزاتی که در این پروژه مورد استفاده قرار گرفته در جدول ۳-۱ بیان شده است.
جدول ۳-۱: تجهیزات مورد استفاده در این پروژه