کونژوگاسیون PRP هموفیلوس آنفولانزای تیپb (Hib) با اگزو توکسین A سودوموناس آئروژینوزا:
برای کونژوگاسیون PRP با اگزو توکسین A ، ۵۰ میلی گرم در ۵ میلی لیتر آب مقطر در دمای اتاق حل و با بهره گرفتن از سود ۱ نرمال حا محلول در ۵/۱۰ تنظیم گردید.۱۵۰ میکرولیتر از محلول سیانوژن بروماید با غلظت ۲/۰گرم در میلی لیتر در استو نیتریل را اضافه کرده و مجدادا PH محلول را در۵/۱۰ تنظیم می کنیم. بعد از ۵ دقیقه ۵ میلی لیتر محلول۵/۰ مولار آدیپیک اسید دی هیدرازید همراه با بیکربنات سدیم با غلظت ۰٫۵ مولار را افزوده و مجددا PH محلول را در ۸٫۵ تنظیم می کنیم. این محلول برای یک شب در دمای ۴ درجه سانتیگراد قرار داده می شود. سپس به نمونه ی کونژوگه آدیپیک اسید با PRP به صورت جداگانه ۵۰ میلی گرم اگزوتوکسین دتوکسیفای شده خالص لیوفلیزه اضافه کرده و مخلوط واکنش روی یخ سرد می شود. PH محلول را در ۵/۸ با بهره گرفتن از HCL 1/0نرمال تنظیم می کنیم.سپس محلول حاوی EDAC با غلظت ۱/۰ نرمال به نمونه اظافه و برای ۴ ساعت بر روی یخ هم زده شده و سپس برای یک شب در دمای ۴ درجه سانتیگراد قرار داده شد.پس از این مدت زمان، محلول در برابر محلول ۲/۰ مولار کلرید سدیم برای ۲ روز دیالیز شد.
۳-۷- ژل فیلتراسیون جهت تخلیص کونژوگه PRP هموفیلوس آنفولانزای تیپb (Hib) با اگزو توکسین A سودوموناس آئروژینوزا
جهت خالص سازی مولکولهای کونژوگه از مولکولهای غیر کونژوگه، نمونه کونژوگه تهیه شده PRP- ETA با حجم۴ میلی لیتر از ستون ژل فیلتراسیون حاوی سفارز ۴B-CL با حجم کاری CM90CM5/1 که با محلول کلرید سدیم ۲/۰مولار به تعادل رسیده عبور داده شد. جریان بافر با سرعت ۴۰ میلی لیتر در ساعت برقرار شد و تا عبور معادل یک حجم بستهی، مایع از ستون ادامه یافت. فراکشنهای جمع آوری شده در طول موج ۲۸۰ و۲۱۰ نانومتر قرائت شدند و لولههایی که بیشترین جذب را داشتند به عنوان فراکشنهای حاوی مولکول کونژوگه جمع آوری و با هم ادغام شدند. سپس کونژوگههای تهیه شده با کمک اولتراسانتریکان، تغلیظ و از فیلتر ۲۲/۰ میکرون میلی پور عبور داده شد و در ویالهای استریل تقسیم ودر ۲۰- درجه نگهداری گردید.
۳-۸- آزمون های کنترل و کیفی کونژوگه
۳-۹- سنجش پروتئین :
میزان پروتئین کونژوگه PRP-ETA به روش LOWRY (1951) انجام شد.
۳-۱۱- تعیین میزان اسید نوکلئیک :
اسید نوکلئیک موجود یک گرم پروتئین لیوفیلیزه شده به روش مطابق بند ۳-۵ اندازه گیری شد.
۳-۱۲- کنترل توکسیسیته غیرعادی((Abnormal toxicity
یک گروه ۵ تایی موش سفید آزمایشگاهی هر کدام با ۵۰ میکروگرم از کونژوگه به صورت داخل صفاقی تزریق نمودیم. قبل و بعد از تزریق وزن ۲۲-۱۷ گرم به صورت داخل صفاقی تزریق گردید و موشها هر روز به مدت ۲ هفته از لحاظ کاهش وزن، عوارض به مدت یک هفته موش ها وزن گردیدند و همگی موش ها از لحاظ کاهش وزن، مرگ و میر و علائم ناخواسته در محل تزریق مورد کنترل قرار گرفتند.
۳-۱۳- آزمون پیروژنی
برای انجام آزمون پیروژنی سه خرگوش سفید نیوزلندی با وزنkg 5/1-2 استفاده گردید. به میزان دو برابر دوز تزریقی یعنی مقدار ۱۰۰ میکروگرم کونژوگه PRP هموفیلوس آنفولانزای تیپb (Hib) با اگزو توکسین A سودوموناس آئروژینوزا را در ml1 سرم فیزیولوژی آپیروژناز از طریق رگ مارژینال به گوش خرگوش تزریق گردید. قبل از تزریق و به مدت ۵ ساعت، هر یک ساعت حرارت رکتال خرگوش ها اندازه گیری شد که اگر افزایش حرارت بدن هر خرگوش کمتر از ۶/۰ و مجموع حرارت بدن هر سه خرگوش کمتر از ۴/۱ باش، کونژوگه غیر تب زا گزارش می شود.
۳-۱۴- ایمیونیزاسیون خرگوشها و خونگیری
برای ارزیابی ایمونولوژیکی در این تحقیق از خرگوش سفید نیوزلندی با وزن ۵/۱ الی ۲ کیلوگرم استفاده گردید. به ۲ گروه ۲ تایی خرگوش به ترتیب، به گروه اول ۵/۰ میلی لیتر حاوی ۵۰ میکرو گرم پلی ساکارید PRP هموفیلوس آنفولانزای تیپb به صورت داخل عضله به هر خرگوش تزریق گردید و به گروه دوم ۵/۰ میلی لیتر حاوی۵۰ میکرو گرم از کونژوگه به صورت داخل عضله به هر خرگوش تزریق گردید. به همین ترتیب تزریق مجدد در روز پانزدهم انجام گرفت.قبل از تزریق اول و در روزهای ۱۵، ۳۰، ۴۵ خونگیری از قلب خرگوش ها انجام شد و سرم آن ها به وسیله سانتریفیوژ جدا گردید و سرم هر گروه خرگوش در هر مرحله با هم مخلوط و با اضافه نمودن ۱ به ۱۰۰۰۰ مرتیولات نگهداری گردید.
۳-۱۵تهیه بافر باربیتال :
الف) محلول A : 12 گرم باربیتات سدیم را در ۸۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل می نماییم.
ب) محلول B : 4/4 گرم باربیتوریک اسید را در ۱۵۰ میلی لیتر آب مقطر در ۹۵ درجه سانتی گراد حل می نماییم.
ج) محلول C : محلول A و B را با هم مخلوط کرده و pH آن را با سود ۵ مولار در ۲/۸ تنظیم نمودیم. سپس ۱۵/۰ گرم مرتیولات به آن افزوده و حجم نهایی را با آب مقطر به یک لیتر رساندیم. محلول فوق را با کاغذ صافی فیلتر می نماییم.
۳-۱۶- تهیه محلول کوماسی بلو و رنگ بر :
الف) محلول رنگ بر : به ۴۰۰ میلی لیتر متانول ۷۰ میلی لیتر اسید استیک گلایسال و ۵۳۰ میلی لیتر آب مقطر اضافه نموده و سپس فیلتر می نماییم.
ب) تهیه محلول کوماسی بلو : ۲۵/۱ گرم رنگ کوماسی برلیانت آبی R-250 سیگما را در : ۵۰۰ میلی لیتر محلول رنگ بر حل نموده و پس از فیلتراسیون در بطری رنگی نگهداری می نماییم.
روش انجام آزمایش
۱ گرم آگاروز را در ۱۰۰ میلی لیتر بافر باربیتال (۶/۸ =pH ) حل نموده و ۰۱/۰ درصد سدیم آزاید اضافه گردید. سپس آن را با حرارت ذوب نمودیم. بعد از سرد شدن ژل و رسیدن به دمای ۴۵ درجه سانتی گراد، در پلیت ریخته شد، به طوری که ارتفاع آن ۳ میلی لیتر برسد و پس از سرد شدن و بستن ژل با بهره گرفتن از دستگاه ایجاد کننده گوده [۱۰۳] ، حفره هایی در ژل ایجاد نمودیم.
به منظور جلوگیری از پخش شدن آنتی ژن یا آنتی بادی در سطح بین شیشه و ژل ، محلولی از آگاروز ۵/۰ درصد در کف حفره ها می ریزیم. حفره ها به قطر ۴ میلی متر و با فاصله ۱ سانتی متر از یکدیگر( یک حفره در مرکز و ۴ حفره در اطراف ) تعبیه شده اند. پس از شماره گذاری حفره ها بر اساس الگوی طراحی شده، کونژوگه در حفره مرکزی و سرم حیواناتی که توسط پلی ساکارید تنها و کونژوگه ایمنی زایی شده بود و نیز پلی ساکارید مننژیتAبه عنوان کنترل منفی و آنتی سرم مننژیت در حفره های اطراف ریخته شدهو پلیت ۱تا ۳ روز در اتاقک مرطوب در دمای آزمایشگاه قرار گرفتند تا خط رسوبی تشکیل گردد. با مشاهده خط رسوبی ژل ها به مدت ۲۴ ساعت در محلول PBS10 میلی مولار (۲/۷ =pH) قرار گرفته و در طی این مدت، بافر چندین بار تعویض می گردد. سپس با قرار دادن ژلها در آب مقطر به مدت ۲ ساعت نمکهای اضافی را خارج می نماییم. ژل به مدت ۱۵-۱۰ دقیقه در رنگ کوماسی بلو قرار گرفته تا خطوط رسوبی ظاهر شوند و سپس آن را در ظرف محتوی محلول رنگ بر حاوی ۱۰ درصد گلیسیرین قرار داده تا زمینه کاملا بی رنگ شود.
در نهایت ژل را با کاغذ صافی مرطوب پوشانده و در حرارت اتاق خشک می نماییم.
۳-۱۶- پلی آکریل آمید ژل الکتروفورز درحضور سدیم دو دسیل سولفات(SDS-PAGE)
۳-۱۶-۱- اصول روش SDS-PAGE
ژل پلی آکریل آمید از پلی مریزاسیون منومرآکریل آمید و واکنش متقاطع این زنجیره پل ی مری با بیس آکریل آمید تشکیل می شود اندازه خلل و فرج تابع غلظت آکریل آمید است؛ یعنی اگر غلظت آکریل آمید افزایش یابد، اندازه خلل و فرج ژل کاهش می یابد و بالعکس. به طوری که به آسانی درجه غربال مولکولی را با تغییر غلظت آکریل آمید و بیس آکریل آمید می توان تغییر داد.
پروتئین ها در حضور یک دترجنت یونی مثل سدیم دو دسیل سولفات (SDS) دناتوره می شوند ومرکاپتواتانول پیوندهای دی سولفید آنها را می شکندSDS . به اسید آمینه های آبگریز در ساختمان پروتئین اتصال برقرار می کند(به نسبت۴/۱ گرم SDSدر هر گرم پروتئین(به طوری که پوششی از بار منفی بر سطح مولکول پروتئین ایجاد می گردد و به این ترتیب تمام پروتئین ها نسبت ثابتی از بار را خواهند داشت و پروتئین ها براساس شکل و اندازه از یکدیگر جدا می شوند. از این رو اگر تفاوتی در حرکت آنها وجود داشته باشد، نشان دهنده اختلاف در اندازه مولکولی است و اندازه مولکول نیز رابطه مستقیم با وزن آن دارد. لذا بدین وسیله وزن مولکولی پروتئین مجهول در مقایسه با پروتئین های استاندارد قابل اندازه گیری خواهد بود.
۳-۱۶-۳- محلولهای مورد نیاز
محلول های مورد استفاده در الکتروفورز
| محلول | مواد تشکیل دهنده |
| استوک آکریل آمید | شامل ۳۰% آکریل آمید و۰/۸% بیس آکریل آمید. |
| بافر ژل پایین با ۸/۸ pH: | ۱۸/۲ گرم تریس بازی (۰/۵ مولار) و ۰/۴ گرم SDS را در ۷۰ میلی لیتر آب مقطر حل کرده وpH را با بهره گرفتن از HCL 2 مولار در ۸/۸ تنظیم می کنیم و اوره با غلظت نهایی ۴ مولار افزوده و حجم نهایی را با آب مقطر به ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم. |
| بافر نمونه | ۰/۱ مولار تریس اسیدی حاوی ۲%SDS (W/V) ، سوکروز ۲۰% (W/V) ، ۲-مرکاپتواتانول ۱% ، ۰/۰۰۱ (W/V) برموفنل بلو و اوره با غلظت نهایی ۸ مولار (این بافر X2 است.) |
۳-۱۶-۴- تهیه ژل پایین SDS-PAGE
