۳-۴- اندازه ­گیری صفات مورد بررسی
در پایان دوره آزمایش، بطور تصادفی گیاهان موجود در هرگلدان برداشت و صفات طول و قطر ساقه اصلی، تعداد گل، تعداد برگ، وزن تر و خشک گل، میزان کلروفیل و کارتنوئید، میزان قندهای محلول، محتوای پرولین، میزان فنول، پراکسید هیدروژن، محتوای نسبی آب برگ و کلروفیل موجود در بافت سبز برگ­ها اندازه ­گیری شدند.
۳-۴-۱- اندازه ­گیری طول ساقه اصلی و قطر گل
طول ساقه با بهره گرفتن از خط کش اندازه ­گیری و مقادیر بر اساس واحد سانتی­مترگزارش شد. قطر گلها نیز توسط خط کش اندازه ­گیری شد.
۳-۴-۲- سنجش تعداد برگ و گل
برای سنجش تعداد برگ، از هر تیمار آزمایشی به طور تصادفی سه بوته انتخاب و تعداد برگ آنها شمارش گردید. برای تعیین تعداد گل در بوته، گلهای کاملا باز شده در هر تیمار شمارش گردید.

۳-۴-۳- وزن تر و خشک اندام هوایی
برای اندازه ­گیری وزن تر و خشک اندام­های هوایی گیاه، در پایان آزمایش، بخش هوایی گیاه از ریشه جدا و بلافاصله وزن تر آن با بهره گرفتن از ترازوی دیجیتالی تعیین شد. سپس نمونه­های مذکور درون آون در دمای ۷۰ درجه سانتی ­گراد، برای مدت ۴۸ ساعت قرار داده شد تا خشک شدند و به کمک ترازوی دیجیتالی وزن خشک آنها نیز تعیین گردید.
۳-۴-۴- سنجش رنگیزه های فتوسنتزی
برای سنجش کلروفیل و کارتنوئید از روش گروس (۱۹۹۱) استفاده شد. ابتدا ۲/۰ گرم از برگهای کاملا توسعه یافته را داخل یک هاون چینی در محیطی خنک و تاریک به خوبی خرد نموده و سپس ۱۰ میلی­لیتر استون به آن اضافه و کاملا هموژنیزه گردید. سپس نمونه ها به مدت ۱۰ دقیقه و با سرعت ۳۵۰۰ دور در دقیقه (rpm) سانتریفیوژ، و محلول های حاصله با استون ۸۰٪ به حجم ۲۵ میلی­لیتر رسیدند. برای سنجش کلروفیل a و b و کارتنوئید به ترتیب از طول موج های ۶۴۵، ۶۶۳ و ۴۷۰ نانومتر با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر جذب محلول حاصله قرائت و با بهره گرفتن از روابط ذیل مقادیر رنگیزه­ها محاسبه گردید. برای صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر از بلانک استون ۸۰٪ استفاده شد.
Chlorophyll a (g/l) = (0.0127*OD663) - (0.00269*OD645(
Chlorophyll b (g/l) = (0.0229*OD645) - (0.00468* OD663(
Total chlorophyll (g/l) = (0.0202*OD645) + (0.00802* OD663(
Car (mg.ml-1) = (1000A470-1.8cha-85.02 chb)/19
OD663: جذب قرائت شده در طول موج برابر ۶۶۳ نانومتر
OD663: جذب قرائت شده در طول موج برابر ۶۶۳ نانومتر
OD663: جذب قرائت شده در طول موج برابر ۶۶۳ نانومتر
۳-۴-۵- سنجش کارتنوئید کل
بدین منظور ۲ گرم از بافت نمونه در ۵۰ میلی لیتر محلول methanol–tetrahydrofuran (با نسبت ۱:۱) هموژن گردیده و پس از سانتریفوژ نمونه­ها در ۲۵۰۰ دور بر دقیقه (rpm)، محلول روئی را برداشته و جذب آن در ۴۵۰ نانومتر اندازه ­گیری شد. با بهره گرفتن از منحنی استاندارد مقدار کاروتنوئید تام نمونه مجهول ارزیابی گردید (Bechoff et al., 2010).
۳-۴-۶- تعیین میزان قندهای محلول کل
قند محلول با بهره گرفتن از روش ایریگوین (۱۹۹۲) اندازه ­گیری شد. به این صوررت که ابتدا ۵/۰ گرم از بافت تازه برگی (برگهای توسعه یافته انتهایی) به همراه ۵ میلی لیتر اتانول ۹۵٪ در داخل هاون چینی کوبیده شد. قسمت بالای محلول حاصله جدا گشته و رسوبات آن دوباره با ۵ میلی­لیتر اتانول ۷۰٪ شستشو و فاز بالایی آن به قسمت رویی قبلی اضافه گردید. محلول به دست آمده در سانتریفیوژ به مدت ۱۰ دقیقه با دور rpm3500 قرار داده شد. سپس فاز مایع رویی برداشته شده و عصاره الکلی به دست آمده تا اندازه گیری قندهای محلول در داخل یخچال (۴ درجه سانتی گراد) نگهداری گردید. برای اندازه گیری قندهای محلول ۱/۰ میلی لیتر از عصاره الکلی نگهداری شده در یخچال به کمک میکروپیپت به داخل لوله آزمایش ریخته و ۳ میلی­لیتر آنترون تازه تهیه شده ( ۱۵۰ میلی گرم آنترون + ۱۰۰ میلی لیتر اسید سولفوریک ۷۲٪) به آن اضافه شد. لوله­های آزمایش به مدت ۱۰ دقیقه در حمام آب جوش تا تشکیل ماده رنگی قرار گرفتند. پس از خنک شدن نمونه­ها، میزان جذب آنها در طول موج ۶۲۵ نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه ­گیری شد. برای اندازه ­گیری مقدار قند از منحنی استاندارد تهیه شده از گلوکز استفاده شد (شکل۳-۵). برای تهیه استاندارد قند، از گلوکز محلول­هایی با غلظت­های صفر تا ۱۲۰ میلی گرم در لیتر تهیه و کلیه مراحل آزمایش روی آنها انجام گردید.
شکل ۳-۳: منحنی استاندارد گلوکز
۳-۴-۷- سنجش اسید آمینه پرولین
اندازه ­گیری میزان اسیدآمینه پرولین با بهره گرفتن از روش بیتس و همکاران (۱۹۷۳) صورت گرفت. بدین ترتیب که ۵/۰گرم ماده خشک گیاهی را درون هاون ریخته، سپس ۱۰ میلی­لیتر سولفوسالسیلیک اسید ۳% (۳ گرم پودر اسید سولفوسالسیلیک را در آب مقطر حل نموده و به حجم ۱۰۰ میلی­لیتر می رسد) آماده شده را به آن اضافه کرده و کاملاً خرد و سپس صاف شد. سپس تیوب را به مدت ۱۵-۱۰ دقیقه در دمای چهار درجه سانتی گراد در ۱۵۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ نموده تا مواد اضافی از محلول جدا گردد. آنگاه مقدار ۲ میلی­لیتر از عصاره صاف شده را درون تیوب ریخته و ۲ میلی­لیتر اسید ناین­هایدرین (مقدار ۲/۱ گرم پودر ناین­هایدرین را در ۳۰ میلی­لیتر اسید استیک گلاسیال حل می نماییم) به آن افزوده، سپس به خوبی مخلوط گردید. همزمان مقدار دو میلی­لیتر از محلول­های استانداردهای صفر، ۴، ۸، ۱۲، ۱۶ و۲۰ میلی گرم در لیتر پرولین را درون تیوب ها ریخته، سپس دو میلی­لیتر اسید ناین­هایدرین و دو میلی­لیتر اسید استیک گلاسیال به آنها افزوده و سپس به خوبی مخلوط گردید. نمونه­ها را به مدت ۹۰ دقیقه در دمای ۱۰۰ درجه سانتیگراد درون حمام آب گرم گذاشته، سپس درون یخ قرار داده شدند. مقدار چهار میلی­لیتر تولوئن به محلول­ها اضافه نموده و آن ها به مدت ۳۰ دقیقه درون دستگاه شیکر قرار گرفتند.
استانداردهای پرولین محلول را در فاز تولوئن در کووت دستگاه اسپکتروفتومتر ریخته و در طول موج ۵۲۰ نانومتر مقدار پرولین قرائت گردید، سپس منحنی استاندارد رسم شده و میزان جذب در نمونه­های گیاهی قرائت شد. در انتها با قرار دادن در معادله خط، مقدار پرولین به دست آید.
توجه: نمونه ها و ناین هایدرین باید در دمای چهار درجه سانتی گراد نگهداری شوند.
۳-۴-۸- تعیین میزان پراکسید هیدروژن (H₂O₂)
برای تعیین غلظت H₂O₂، ۰/۲ گرم از بافت برگی با ۳ میلی­لیتر تری­کلرواستیک­اسید (TCA) 1/0 درصد در یک هاون چینی و محیط یخ سائیده شد. سپس عصاره با دور ۳۵۰۰ دور در دقیقه (rpm) به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ گردید. ۱ میلی­لیتر از مایع رویی به ۱ میلی­لیتر بافر فسفات (۷pH=) و ۲ میلی­لیتر یدید پتاسیم یک مولار اضافه و سپس جذب مخلوط در طول موج ۳۹۰ نانومتر قرائت و مقدار H2O₂ با بهره گرفتن از ضریب خاموشی ۲۸/۰ میکرومتر در سانتی متر محاسبه و بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر بیان گردید (Velikova et al., 2000).
۳-۴-۹- تعیین میزان آب نسبی برگ (RWC)
برای این آزمایش، از قسمت­ های انتهایی ساقه چندین برگ کاملاً توسعه ­یافته جدا و سپس دیسک­هایی به قطر ۸ میلی­متر از قسمت میانی پهنک برگ تهیه شد (از هر واحد آزمایشی ۱۰ دیسک برگی)، سپس دیسک­ها به کمک ترازوی دیجیتالی (با دقت ۰۱/۰ گرم) توزین و به پتری­دیش حاوی آب مقطر به مدت ۳ ساعت در یخچال (۴ درجه سانتی گراد) منتقل گردید. پس از خارج کردن دیسک­ها از آب مقطر جهت حذف رطوبت اضافی سطح دیسک­ها، آنها را روی کاغذ صافی قرار داده و سپس وزن آماس آنها اندازه ­گیری شد. پس از تعیین وزن آماس، دیسک­های برگی به آون (۷۰ درجه سانتی گراد) منتقل و پس از گذشت ۴۸ ساعت وزن خشک آنها تعیین و در نهایت RWC با بهره گرفتن از رابطه ذیل محاسبه شد ((Turner,1981.
میزان آب نسبی برگ = [[(وزن خشک – وزن آماس) / وزن خشک –وزن تر) ×۱۰۰
۳-۴-۱۰- تعیین فنول کل گل
برای تعیین فنول کل، ۱ گرم از گل­های کاملا باز شده توزین و با ۶ میلی­لیتر اتانول خالص مخلوط و هموژنیزه گردیدند. محلول به دست آمده با دستگاه سانتریفیوژ و با دور g×۱۲۰۰۰ به مدت ۱۲ دقیقه سانتریفیوژگردید. سپس ۵۰ میکرولیتر از محلول شناور جدا نموده و با ۵۵۵ میکرولیتر آب مقطر و ۱۰۰ میکرولیتر (V:V / 1:1) معرف فولین­سیکالتو رقیق شد. بعد از سپری شدن ۵ دقیقه در دمای اتاق، ۷۵۰ میکرولیتر از محلول سود نرمال، حاوی ۲۰ گرم در لیتر کربنات سدیم، به هر نمونه اضافه و سپس محلولها به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند. در نهایت میزان جذب نمونه­ها در طول موج ۷۶۰ نانومتر قرائت گردیدند (Lemomoine et al., 2007).
* تمام ترکیبات (۴ میلی لیتر محلول کربنات سدیم + ۵ میلی لیتر فولین + ۵/۰ میلی­لیتر حلال عصاره) به غیر از عصاره، بلانک را تشکیل می دهد (به جای عصاره از ۵/۰ میلی لیتر حلال استفاده شد).
* منحنی استاندارد فنول با غلظت های ۲۵۰ و ۲۰۰ ،۱۵۰ ،۱۰۰ ،۵۰ ،۰ (میلی­گرم بر لیتر) از فنول تهیه گردید (شکل ۳-۶). از همبستگی بین غلظت های بکار برده شده فنول (میلی­گرم بر لیتر) با جذب­های خوانده شده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر برای محاسبه فنول کل عصاره استفاده و بر حسب میلی­گرم بر گرم محاسبه گردید.
شکل ۳-۴: منحنی استاندارد فنول کل
۳-۴-۱۱- تعیین مقدار اسانس کل
برای اندازه ­گیری درصد اسانس از روش تقطیر با آب استفاده می­ شود. جهت استخراج اسانس از گل­های گیاه استفاده می­ شود. بنابراین پس از جمع­آوری و آماده ­سازی، گل­های گیاه داخل محفظه مخصوص گیاه در دستگاه کلونجر قرار داده شد. بدین وسیله اسانس همراه با بخار آب در قسمت سرد کننده جمع، اندازه ­گیری و برحسب درصد بیان می شود.
۳-۴-۱۳- سنجش ترکیبات اسانس
برای شناسایی ترکیبات، اسانس ­های مورد نظر پس از آماده ­سازی به دستگاه GC/MSتزریق شدند تا نوع ترکیبهای تشکیل­دهنده آنها مشخص شود. دستگاه گاز کروماتوگرافی استفاده شده از نوع Agilent 6890 با ستون به طول ۳۰ متر، قطر داخلی ۲۵/۰ میلیمتر و ضخامت لایه ۲۵/۰میکرومتر از نوع HP-5MS بودet al., 2005) (Young-Cheol.
۳-۵- تجزیه و تحلیل آماری داده ­ها
برای انجام تجزیه واریانس و مقایسه میانگین­های صفات اندازه ­گیری شده از نرم افزار SAS نسخه ۱/۹ استفاده شد. مقایسه میانگین­ها با بهره گرفتن از آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطوح احتمال ۱ و ۵ درصد انجام گرفت. همچنین برای رسم نمودار از نرم افزار Excel استفاده گردید.
فصل چهارم
نتایج و بحث
۴- بررسی تاثیر غلظت ازت و نسبت نیترات به آمونیوم بر پارامترهای مورفولوژیکی گیاه همیشه بهار