فصل پنجم
نتیجه گیری کلی و پیشنهادات
بحث
رازیانه، نوعی گیاه دارویی است که مصارف مختلفی دارد. رازیانه با خواص فراوان دارویی، التیام بخش بسیاری از بیماری‌ها از جمله سرفه و سرماخوردگی است. مصرف رازیانه باعث افزایش شیرمادر و نیز کاهش وزن می‌شود همچنین دارای مقدار فراوانی پتاسیم است که باعث کاهش فشارخون می‌شود و به این ترتیب برای افرادی که دچار حمله قلبی می‌شوند، مفید است. این گیاه دارویی، سموم بدن را پاک می‌کند و بیماری‌ التهاب دهان را از بین می‌‌برد. با توجه به اهمیت دارویی رازیانه، مطالعه نقش سیستم کشت سلولی بر ترکیبات موثره رازیانه برای بررسی خصوصیات کمی و کیفی متابولیت ثانویه آن با اهمیت است. از آنجا که کشت بافت گیاهی یکی از مهم‎ترین تکنیک‎ها در راستای تولید صنعتی متابولیت‎های ثانویه در گیاهان دارویی است، ابتدا لازم است بهینه سازی شرایط درون شیشه ای این گیاه با توجه به عوامل مختلفی از جمله ترکیبات مختلف هورمونی، ریزنمونه های متفاوت، نوع رقم و غیره انجام بگیرد.

بدین منظور در این مطالعه اثر غلظت های مختلف ترکیبات هورمونی ۲,۴-D به همراه BAP و NAA به همراه کینتین و ریزنمونه های برگ، ساقه و ریشه بر میزان کالوس زایی و باززایی آن انجام گرفت. نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر این ترکیبات و ریزنمونه ها و اثر متقابل آنها بر درصد کالوس دهی و باززایی نشان داد که همگی در سطح یک درصد معنی دار بودند. بر اساس نتایج مقایسه میانگین بهترین ترکیب هورمونی در میزان کالوس زایی، محیط کشت MS2 که حاوی ۲ میلی گرم بر لیتر هورمون ۲,۴-D و ۵/۰ میلی گرم بر لیتر BAP بود، با ۲/۷۲ درصد شناخته شد. بر اساس این نتایج هورمون ۲,۴-D تاثیر بیشتری بر میزان کالوس زایی نسبت به NAA داشت.
با توجه به این نتایج می‌توان گفت حضور منابع اکسین مانند ۲,۴-D و NAA جهت القای کالوس در محیط کشت ضروری می‌باشند و غلظت بالای هورمون ۲,۴-D بر روی درصد کالوس‌زایی تأثیر منفی نشان داد (قاسمی یزدی، ۱۳۹۰؛ بائوهانگ^[۷۱] و همکاران، ۲۰۰۸). همچنین تایلر^[۷۲] و همکاران (۱۹۹۱) بیان داشتند غلظت کمتر سیتوکینین به اکسین سبب کال زایی بیشتر می شود. در نتایج امیدی و همکاران (۱۳۸۸) نیز بیشترین محیط کشت تولید کننده کالوس، ۲,۴-D با غلظت ۲ میلی گرم بر لیتر که کمترین غلظت اکسین بود با غلظت های ۲۵/۰ و ۵/۰ BAP که با نتایج این آزمایش کاملا مطابقت دارد.
همچنین مناسب ترین ریزنمونه از جهت ایجاد بیشترین کالوس زایی ریزنمونه های ریشه و ساقه بودند که به ترتیب ۸/۵۲ و ۵۰ درصد کالوس دهی داشتند. نتایج اثر متقابل این ترکیبات هورمونی و ریزنمونه بر میزان کالوس زایی نشان داد که بهترین ریزنمونه و ترکیب هورمونی ریشه در محیط کشت MS2 با ۱۰۰ درصد بود. و کمترین کالوس زایی در برگ مشاهده شد. این نتایج با نتایج امیدی و همکاران (۱۳۸۸) مبنی بر اینکه بهترین ریزنمونه در تولید بیشترین کالوس زایی محور زیر لپه است و برگ کمتر از سایر ریزنمونه ها کالوس زایی ایجاد می کند، تطبیق دارد. این نتایج حاکی از آن است که میزان کالوس ایجاد شده در ریزنمونه های مختلف متفاوت است که با نتایج بهروز (۱۳۸۸) و مرادزاده (۱۳۸۸) مبنی بر اینکه نوع ریزنمونه در میزان کالوس بدست آمده متفاوت است مطابقت می کند.
به‎طور کلی می‎توان نتیجه گرفت که حضور منابع اکسین مانند هورمون ۲,۴-D و NAA جهت القای کالوس در محیط کشت ضروری می‌باشند، گرچه غلظت بالاتر اکسین اثر بازدارنده‎ای در تولید کالوس نشان داد. از این نتایج می توان بیان داشت که تنظیم کننده های رشد گیاهی تاثیر مستقیمی بر میزان کالوس زایی گیاه رازیانه دارد و بهترین محیط کشت برای کالوس زایی بیشتر این گیاه تعیین شد. همچنین غلظت‌های بالای تنظیم کننده های رشد گیاهی سبب تشکیل ساقه‌ی غیرطبیعی و القای کالوس‌زایی می‌شود. درحالیکه غلظت بالاتر اکسین و غلظت کم سیتوکینین منجر به القای کالوس می گردد.
از لحاظ باززایی نیز بهترین محیط کشت، MS2 بود که حاوی ترکیب هورمونی ۲ میلی گرم بر لیتر هورمون ۲,۴-D و ۵/۰ میلی گرم بر لیتر BAP می باشد و ۲/۷۲ درصد باززایی ایجاد کرد. از میان ریزنمونه ها، ریشه و ساقه به ترتیب با ایجاد ۶/۵۵ و ۲/۴۷ درصد بیشترین میزان باززایی را داشتند. اثر متقابل ترکیبات هورمونی و ریزنمونه ها بر میزان باززایی نیز نشان داد که ریزنمونه ریشه در محیط کشت MS2 با ۷/۹۱ درصد بالاترین باززایی را دارد.
نتایج رائو^[۷۳] و همکاران (۲۰۰۶) اعلام داشتند احتمالا استفاده از غلظت‌های بالای هورمون اکسین اثر بازدارنده بر کالوس‌زایی و باززایی دارد. همچنین در نتایج امیدی و همکاران (۱۳۸۸) بیشترین باززایی در محیط کشت بدون هورمون بود و با افزایش غلظت اکسین بر میزان باززایی کاسته می شد. بنابراین می توان نتیجه گرفت که اکسین اثر منفی بر باززایی دارد. همچنین اسلام^[۷۴] و همکاران (۲۰۱۰) نیز بیان داشتند غلظت پایین هورمون‌های گیاهی برای باززایی گیاه مناسب بودند و غلظت‌های بالای آنها سبب تشکیل ساقه‌ی غیرطبیعی و القای کالوس‌زایی می‌شود. درحالیکه غلظت بالاتر اکسین و غلظت کم سیتوکینین منجر به القای کالوس می گردد (قاسمی یزدی، ۲۰۱۱).
این نتایج نشان می دهد با افزایش هورمون NAA میزان باززایی افزایش یافته است اما با افزایش غلظت ۲,۴-D تا ۲ میلی گرم بر لیتر میزان باززایی افزایش یافته است اما در ادامه غلظت میزان باززایی کاهش یافت. احتمالا استفاده از غلظت‌های بالای هورمون اکسین اثر بازدارنده بر کالوس‌زایی و باززایی دارد. بنابراین می توان نتیجه گرفت که اکسین اثر منفی بر باززایی دارد. غلظت پایین هورمون‌های گیاهی برای باززایی گیاه مناسب بودند.
به طور کلی نتایج نشان دادند که ترکیب هورمونی ۲,۴-D به همراه BAP، کالوس زایی و باززایی بهتری را نسبت به ترکیب هورمونی NAA به همراه کینتین داشت و غلظت ۲ میلی گرم بر لیتر ۲,۴-D نسبت به سایر غلظت های ۲,۴-D از لحاظ تولید کالوس بیشتر و برای باززایی مناسب تر بود.
این نتایج نشان می دهد با افزایش هورمون NAA میزان باززایی افزایش یافته است اما با افزایش غلظت ۲,۴-D تا ۲ میلی گرم بر لیتر میزان باززایی افزایش یافته است اما در ادامه غلظت میزان باززایی کاهش یافت. نتایج رائو^[۷۵] و همکاران (۲۰۰۶) اعلام داشتند احتمالا استفاده از غلظت‌های بالای هورمون اکسین اثر بازدارنده بر کالوس‌زایی و باززایی دارد. همچنین در نتایج امیدی و همکاران (۱۳۸۸) بیشترین باززایی در محیط کشت بدون هورمون بود و با افزایش غلظت اکسین بر میزان باززایی کاسته می شد. بنابراین می توان نتیجه گرفت که اکسین اثر منفی بر باززایی دارد. همچنین اسلام و همکاران (۲۰۱۰) نیز بیان داشتند غلظت پایین هورمون‌های گیاهی برای باززایی گیاه مناسب بودند و غلظت‌های بالای آنها سبب تشکیل ساقه‌ی غیرطبیعی و القای کالوس‌زایی می‌شود. درحالیکه غلظت بالاتر اکسین و غلظت کم سیتوکینین منجر به القای کالوس می گردد (قاسمی یزدی، ۲۰۱۱).
در آزمایش بررسی اثر غلظت های مختلف هورمون BAP (25/0، ۵/۰ و ۱ میلی گرم بر لیتر) بر اندازه ساقه، اندازه ریشه و تعداد برگ در گیاه رازیانه، نتایج آنالیز واریانس اختلاف معنی داری را تنها در میان غلظت های مختلف هورمون بر اندازه ساقه نشان داد که بهترین غلظت ها، ۵/۰ و ۱ میلی گرم بر لیتر هورمون BAP بودند که به ترتیب با ۷/۵ و ۲/۵ سانتیمتر ساقه زایی داشتند. این نتایج نشان داد که با بیشتر شدن میزان سیتوکینین بر میزان رشد ساقه اثر منفی دارد.
با توجه به نتایج آنالیز واریانس اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر اندازه ریشه و تعداد برگ اختلاف معنی داری را نشان نداد. در هر سه غلظت، گیاه ۱۲ عدد برگ ایجاد کرد. با وجود اینکه نتایج میزان اندازه ریشه اختلافی را نشان ندادند اما می توان بیان کرد بهترین غلظت برای اندازه ریشه، ۵/۰ میلی گرم بر لیتر BAP بود که ۷/۲ سانتیمتر ریشه دهی را ایجاد کرد. این نتایج نشان داد که میزان غلظت هورمونی بر میزان ریشه زایی تاثیری هرچند اندک داشته است و افزایش غلظت سیتوکینین سبب کمتر شدن ریشه زایی می شود که با نتایج قاسمی یزدی (۱۳۹۰) مبنی بر اینکه هورمون اکسین محرک ریشه زایی است و سیتوکینین اثر کمی بر ریشه زایی دارد، مطابقت می کند.
در آخرین آزمایش که ترکیبات شیمیایی مختلفی از گیاه رازیانه از طریق کشت سوسپانسیون سلولی تیمار شده با ترکیبات هورمونی مختلف (۲,۴-D 1 و BAP 0.5، ۲,۴-D 2 و BAP 0.5، ۲,۴-D 2 و BAP 1 و Kin 0.25) استخراج شدند، ترکیباتی چون (E,E) 2,4-Decadienal و D-(+)-fenchone میان تیمارها مشترک بودند. بالاترین درصد سطح ترکیب شیمیایی (E,E) 2,4-Decadienal با ۸۶/۵۴ درصد در تیمار ۲,۴-D 2 و BAP 1 شناسایی شد. همچنین بالاترین درصد سطح ترکیب شیمیایی D-(+)-fenchone با ۳۳/۵۳ در تیمار ۲,۴-D 1 و BAP 0.5 مشاهده شد. در ترکیب هورمونی ۲,۴-D 1 و BAP 0.5 بالاترین میزان سطح با ۶۸/۶۹ درصد مربوط به ترکیب شیمیایی ɑ-phellandrene بود.
به طور کلی این نتایج نشان داد که ترکیب شیمیایی (E,E) 2,4-Decadienal در گیاه رازیانه که تحت تاثیر غلظت های هورمونی قرار گرفته است بیشتر می باشد. که این نتایج با نتایج اردکانی و همکاران (۱۳۸۳) مبنی بر اینکه در کالوس گیاه رازیانه ترکیب شیمیایی (E,E) 2,4-Decadienal درصد سطح بیشتری دارد مطابقت می کند.
پیشنهادات

1. 1. از آنجایی که برای بهینه سازی شرایط رشد رازیانه تنها از برخی تنظیم کننده های رشد گیاهی استفاده شد، لذا پیشنهاد می شود در مطالعات بعدی از غلظت های متنوع تری از این ترکیبات هورمونی و دیگر تنظیم کننده های رشد گیاهی استفاده شود.

1. 1. بکارگیری تنظیم کننده های رشد گیاهی بر اثر ریزنمونه های دیگر گیاه رازیانه چون هیپوکوتیل (محورزیرلپه)، جوانه جانبی و جوانه انتهایی بر میزان کالوس زایی و باززایی آن.

1. 1. برای دست یافتن به اسانس بیشتر این گیاه دارویی لازم است تحقیقات بیشتری در زمینه افزایش میزان اسانس آن از طریق محیط کشت های مختلف در شرایط متفاوت انجام گیرد. همچنین لازم می باشد اثر این شرایط را بر افزایش صفات مورفولوژیکی، میزان رشد و میزان بیوماس گیاه سنجید.

1. 1. با توجه به گستردگی انواع گیاهان دارویی در ایران و این نکته که بسیاری از اسانس های موجود در گیاهان دارویی ایران ناشناخته می باشند، انجام تحقیقات بیشتر در این زمینه برای شناسایی آنها پیشنهاد می گردد.

1. 1. پیشنهاد می شود در رابطه با بعضی از خواص اسانس ها از جمله خصوصیات ضد میکروبی و طیف اثربخشی آنها تحقیقات گسترده ای در خصوص گونه های مختلف گیاه رازیانه انجام گیرد.

1. 1. می توان اسانس های یک گونه خاص را در فصل های مختلف در یک منطقه از لحاظ شرایط یکسان آب وهوایی و همچنین در چندین منطقه متفاوت از لحاظ شرایط آب و هوایی و یا اندام مختلف در مراحل مختلف رشد مقایسه و تاثیر آنها را بر روی میزان و نوع ترکیبات مورد بررسی قرار داد و با توجه به نتایج به دست آمده بانک اطلاعاتی مفیدی از شرایط لازم جهت دستیابی به درصد بالایی از یک ماده خاص در اسانس آن گونه را فراهم کرد.

منابع
اربابیان ص، مغانلو م. )۱۳۸۸). بررسی نوع و غلظت برخی تیمارهای هورمونی در کشت بافت گونه درمعرض خطر انقراض گون­گچی(Astragalus fridae Rech. f) فصلنامه زیست­شناسی تکوینی. سال اول. شماره۲.
آروین، ج.)­۱۳۸۱­(. کشت بافت درختان چوبی(ترجمه). انتشارات دانشگاه شهید باهنر کرمان.
ایزد پناه، م. (۱۳۸۰). ازدیاد گیلاس وحشی(Prunus avium) از طریق کشت درون شیشه ای. مجله پژوهش و سازندگی، ۵۲: ۷۴- ۶۸ .

اورمزدی، پ. و چلبیان، ف. ۱۳۸۴. مطالعه کشت بافت و اندام‌زایی در گیاه دارویی Salvia nemorosa. فصلنامه پژوهشی تحقیقات ژنتیک و اصلاح گیاهان مرتعی و جنگلی ایران، ۱۴: ۶۹ تا ۷۹.
اردکانی، م .، دانشیان، ج .، اصلان، ع ، (۱۳۸۳). نهمین کنگره علوم زراعت و اصلاح نباتات.
اسمیت ، (۲۰۰۲). کشت بافت گیاهی، تکنیک ها و آزمایش ها. مترجمین : مهندس هدایت باقری، مهندس پیمان آزادی. جهاد دانشگاهی مشهد.
ایوانز ، کولمن ، کارنز . ( ۱۳۸۵) . کشت بافت گیاهی . مترجمین : آرش فروتن ، ریحانه وادی وار . مرکز نشر سپهر.
باقری، ع .، زیارت نیا، م.، حسینی، م. (۱۳۸۳). کشت بافت درختان. انتشارات دانشگاه مشهد.
باقری ، ع .، صفاری ،م. (۱۳۷۶) . مبانی کشت بافت گیاهی. انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد.
بهروز آ. )۱۳۸۸). بررسی تحمل به شوری ژنوتیپ‌های مختلف پنبه در شرایط درون‌شیشه‌ای. پایان‌نامه کارشناسی ارشد. دانشکده کشاورزی. دانشگاه آزاد اسلامی اردبیل.
پیری ، خسرو . نظریان فیروز آبادی ، فرهاد. (۱۳۸۰).راهنمای کشت بافت گیاهان. انتشارات بوعلی سینا.
پیریک ، آر . ال . ام. (۱۳۷۶) . مبانی کشت بافت های گیاهی . ترجمه عبدالرضا باقری . انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد.
توحیدفر م و کاویانی م. (۱۳۸۹). بیوتکنولوژی پنبه و جنبه‌های ایمنی زیستی آن. انتشارات پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران. ۲۳۲ص.
خواجه الدینی، م.(­۱۳۸۰). بررسی ریزازدیادی سبب، پایه MN106(مالینگ مرتون۱۰۶) با بهره گرفتن از تکنیک های کشت بافت. پایان نامه کارشناسی ارشد، دانشگاه آزاد واحد علوم و تحقیقات تهران.
دانشور حسینی، ع. (۱۳۸۷(. بررسی امکان ریزازدیادی و غربالگری ژنوتیپ های پاکوتاه محلب(mahaleb L. Prunus ) بر مبنای سهولت تکثیر در شرایط In vitro. پایان نامه کارشناسی ارشد.دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی. دانشگاه آزاد علوم و تحقیقات تهران.
دژم پور، جلیل.(۱۳۸۶). ارزیابی قابلیت ریزازدیادی و تحمل به شوری در چندپایه دورگه بین گونه ای جنسPrunus. پایان نامه دکتری. دانشکده کشاورزی. دانشگاه تبریز.
ذوالفقاری نسب، ر. (۱۳۸۲). بررسی مناسب ترین روش ازدیاد دورگه زردآلو × گوجه در شرایط درون شیشه ای. پایان نامه کارشناسی ارشد. دانشکده کشاورزی. دانشگاه تبریز.
روزبان، م.، ارزانی، ک.، معینی، ا. (۱۳۸۱) . بررسی ریزازدیادی درون شیشه ای برخی از ارقام گلابی آسیایی. نهال و بذر. ۱۸(۳) :۳۴۸-۳۶۱.
سرخیل پانته آ، امیدی م، پیغمبری ع، دوازده امامی س. (۱۳۸۸). تاثیر هورمونی و ریزنمونه بر کالزایی، باززایی و کشت سوسپانسیون سلولی در رازیانه (Foeniculum vulgare Mill). فصلنامه علمی پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، جلد ۲۵، شماره ۳، صص ۳۶۴-۳۷۵.
شریفی، م.، م. آقایی زاده، م. نیرومندی جهرمی، س. دارابی و ل. جوکار. (۱۳۸۹). ارزیابی ژنوتیپ های اوتایپ از نظر تحمل به ریزومانیا. یازدهمین کنگره زراعت و اصلاح نباتات ایران.دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران.۲-۴ مرداد. ص ۴۳۲-۴۳۶.