۱۱-۱- ریزازدیادی^۵
ریزازدیادی فرایند رشد رویشی و تکثیر از بافت یا دانه گیاهان می باشد. ریزازدیادی با بهره گرفتن از حداقل فضا و مکان، شرایط مناسبی را برای رشد گیاهان ایجاد می کند. مزایای استفاده از ریزازدیادی به شرح زیر است:

۱- مقادیر بالای تکثیر
۲- کنترل محیط و فراهم کردن احتیاجات گیاه
۳- در دسترس بودن گیاه در تمام طول سال (مستقل از تغییرات منطقه ای و فصلی)
۴- شناسایی و تولید کلون ها با ویژگی های مورد نظر
۱- Embryo culture
۲- Callus culture
۳- Cell culture
۴- Protoplast culture
۵- Micropropagation
۵- تولید متابولیت های ثانویه
۶- حفاظت از گونه های در معرض انقراض
۷- حفاظت از مواد ژنتیکی با روش های حفاظت انجمادی
به منظور استفاده از تکنیک ریزازدیادی روش های مختلفی مانند کشت کالوس، کشت سوسپانسیون سلولی، جنین زایی سوماتیکی و کشت پروتوپلاست استفاده می شود (Sidhu, 2010).
۱۲-۱- تمایز سلولی
سلولهای بافت کالوس طبیعت پارانشیمی دارند. در طی تمایز به یک گیاه کامل، این سلولها بایستی به انواع مختلفی از سلولها تمایز یابند که این پدیده به تمایز سلولی معروف می باشد. در گیاه عادی تمایز بافت ها به طور مشخص با توجه به خصوصیات اندام و گونه گیاه ادامه می یابد. معذالک کشت های کالوس از آنجا که فاقد عناصر آوندی هستند، برای مطالعه تأثیر انواع مواد شیمیایی و عوامل فیزیکی در تمایز بافت آوندی، سیستمی ارزشمند به شمار می آیند. اکسین و ساکارز تأثیر عمده ای بر تمایز بافت های آوندی دارند، در حالیکه سیتوکینین ها و جیبرلین ها تمایز بافت آوندچوبی را سرعت می بخشند. عموماً اکسین در غلظت پایین (۵/۰ میلی گرم در لیتر) تولید آوند چوبی را تحریک نموده و ارتباط معکوسی بین غلظت اکسین و میزان تمایز بافت آوند چوبی وجود دارد. بعلاوه مشاهده شده است که تأثیر اکسین بر تمایز بافت آوندی به حضور قندها بستگی دارد. همچنین فاکتورهای فیزیکی نظیر دما و درجه حرارت تأثیر شناخته شده ای بر تمایز بافت آوندی دارد (فارسی، ۱۳۸۴).
۱۳-۱- تمایز اندام
در طبیعت، خاصیت توانمندی سلولهای سوماتیکی در گیاهان مختلف دیده شده است. به طوری که قطعات بزرگ ساقه و ریشه قادرند در اثر تمایز ساقه و ریشه تولید کنند. مطالعات در شرایط درون شیشه ای نشان داده است که خاصیت توانمندی سلولی به چند گونه اندک محدود نمی باشد و اغلب گونه های گیاهی اگر در شرایط مناسب قرار گیرند، تمایز نشان خواهند داد. برای باززایی یک گیاه کامل از یک سلول یا بافت کالوس، تمایز سلولی کفایت نمی کند و تمایز بایستی به شکل گیری جوانه ساقه یا جنین منجر شود. این امر با اندام زایی^۱ یا جنین زایی رویشی تحقق می یابد. در اندام زایی، یک ساختار تک قطبی که متصل به بافت آوندی اولیه درون کالوس است تشکیل می شود ولی در جنین زایی یک ساختار دو قطبی بدون هیچ گونه اتصال آوندی با بافت کالوس مادری یا ریزنمونه شکل می گیرد (فارسی، ۱۳۸۴).
۱۴-۱- اندام زایی
در کشت بافت گیاهی، اندام زایی فرایندی است که طی آن اندام های گیاهی نظیر ساقه، ریشه، جوانه گل و غیره تولید می شوند. این فرایند عبارت است از تولید اندام ها و جنین های گیاهی ( ساختارهایی شبه جنین) از نقاطی غیر عادی نسبت به بافت مادری بر روی یک ریزنمونه سازمان یافته که فاقد هرگونه سیستم از قبل تشکیل شده می باشد. ساقه ها و ریشه های نابجا از بافت هایی منشأ می گیرند که در حالت طبیعی این اندام ها را تولید نمی نمایند. ساقه های نابجا، ساختارهایی متشکل از ساقه و برگ هستند که از بافت های گیاهی در مکانهایی غیر از زاویه برگ منشأ می گیرند. گیاه کامل باززایی شده با این روش، یک ساختار تک قطبی می باشد. این گیاه یک سری رشته های پروکامبیومی^۲ تولید می نماید که این رشته ها با شبکه آوندی موجود گسترش یافته در بافت کالوس یا ریزنمونه کشت شده ارتباط برقرار می نماید. فرایند اندام زایی از جنین زایی سوماتیکی متداول تر است و در تکثیر رویشی به صورت انبوه، پتانسیل خیلی بیشتری دارد. تولید گیاه به روش اندام زایی به دو طریق امکان پذیر است:
۱- اندام زایی از بافت کالوس
۲- اندام زایی به طور مستقیم از ریزنمونه (فارسی، ۱۳۸۴).
۱- Organogenesis
۲- Procambium
۱-۱۴-۱- اندام زایی از بافت کالوس
باززایی گیاه از ریزنمونه های کشت شده، مستلزم تولید کالوس و سپس تمایز جوانه ساقه از این بافت کالوس می باشد. ایجاد ساقه، ریشه، گل آذین جوان، گلبرگ ها و جنین در شرایط درون شیشه ای صورت می گیرد. برای باززایی موفق گیاه در هر گونه و یا رقم ویژه ممکن است به ریزنمونه خاصی نیاز باشد. ریزنمونه های حاصل از اندام های بالغ و نابالغ را می توان در تهیه کالوس و سپس باززایی گیاه، مورد استفاده قرار داد.با این حال معمولاً ریزنمونه های دارای سلول های فعال میتوزی، برای تولید کالوس مناسب تر هستند. بافت ها و اندام های نابالغ در کشت درون شیشه ای از نظر ظاهری نسبت به بافت های بالغ انعطاف پذیرترند. اندازه و شکل ریزنمونه نیز مهم است. درصد کمی از سلول های ریزنمونه در تشکیل کالوس شرکت می نمایند. محل تشکیل کالوس معمولاً در سطح پیرامون ریزنمونه و یا در سطح بریده شده است. بافت کالوس در اثر ایجاد زخم و یا در پاسخ به هورمون های اضافه شده در محیط کشت ایجاد می شود. برای انتخاب ریزنمونه بایستی اندام های مریستمی نظیر نوک ساقه، جوانه جانبی، گل آذین، ساقه، برگ، دمبرگ و ریشه، بر سایر بافت ها ترجیح داده شوند، چرا که این بافت ها دارای خصوصیات ارزشمندی نظیر خصوصیات کلونی، بقاء کشت، سرعت رشد و خاصیت توانمندی سلولی در کشت های درون شیشه می باشند. مریستم ها، نوک ساقه ها و جوانه های جانبی، برگ ها و جنین های نابالغ، به ویژه در غلات ریزنمونه های خوبی هستند. ریزنمونه هایی نظیر برگ های بالغ، ریشه، دمبرگ و اجزای گل، می توانند با موفقیت برای تولید گیاهچه به روش اندام زایی مورد استفاده قرار گیرند. فصل سال، سن و وضعیت فیزیولوژیکی گیاه دهنده ریزنمونه نیز در موفقیت اندام زایی نقش دارند. محیط کشت های مختلفی از جمله MS¹، B5²، وایت^۳ و SH⁴ برای اندام زایی مورد استفاده قرار می گیرند. محیط کشت MS بر خلاف محیط های دیگر، محتوی مقادیر زیادی نیتروژن آمونیومی می باشد.در روش اندام زایی معمولاً از دو نوع کشت سلولی استفاده می شود:
۱- Murashig and skoog
۲- Gamborg B5 medium
۳- White
۴- Schenk and Hilderandt
۱- کشت توده های سلولی در سطح محیط کشت جامد
۲- کشت تعلیق سلولی در محیط کشت مایع
غلظت مواد تنظیم کننده رشد در محیط کشت برای اندام زایی بسیار مهم است. اکسین با غلظت متوسط تا زیاد اولین هورمون مورد استفاده برای تولید کالوس است. غالباً از هورمون ۲,۴-D که اکسین بسیار نیرومندی است، به تنهایی برای القای کالوس استفاده می شود. در بعضی از گونه ها غلظت زیاد اکسین و غلظت کم سیتوکینین در محیط کشت، روند تولید کالوس را تسریع می کند. سیتوکینین های مورد استفاده کینتین یا BAP می باشند. بافت کالوس متشکل از گستره وسیعی از انواع سلول های واکوئل دار با تمایز نامنظم است که تعداد کمتری سلول های مریستمی در بین آنها پراکنده می باشد. ماهیت بافت کالوس به بافت ریزنمونه و یا بافت هایی که ریزنمونه از آن منشأ گرفته است و همچنین ترکیب محیط کشتی که برای تولید و نگهداری آن بکار می رود، بستگی دارد. کالوس را می توان با تهیه واکشت های مکرر برای مدت زمان طولانی نگه داشت، اما ترکیب و ساختار آن ممکن است به مرور زمان تغییر کند. چرا که محیط کشت به نفع سلول های معینی عمل نموده و باعث غالب شدن آنها می شود. تحت شرایط رشد مناسب برای رشد سازمان نیافته، سلول های مریستمی به طور تصادفی و پراکنده در بافت کالوس قرار دارند. انتقال قطعات کالوس به شرایطی که موجب رشد سازمان یافته شود، به تشکیل مریستموئیدها که مراکز رشد نیز نامیده می شوند، می انجامد. مریستموئیدها، توده های متمرکزی از سلولهای شبه کامبیومی هستند که ممکن است به دلیل ظهور سلولهای تراکئیدی در مرکز، به آوند مجهز شوند. این توده ها محل تشکیل اندام در بافت کالوس بوده و قادر به تولید ساقه یا ریشه می باشند. اندام زایی هم از کشت تعلیق سلولی و هم از کشت های کالوس امکان پذیر است. فقط لازم است سلول ها را از محیط کشت کالوس به محیط کشت خاص باززایی انتقال داده و سپس بطور مرتب در محیط باززایی تجدید کشت نمود (فارسی، ۱۳۸۴).
۲-۱۴-۱- اندام زایی نابجا به طور مستقیم
بافت های رویشی گیاهان عالی تحت شرایط ویژه قادر به تولید گیاهان نابجا می باشند. جوانه های نابجا، جوانه هایی هستند که مستقیماً از یک اندام گیاهی یا یک قطعه متعلق به آن و بدون نیاز به کالوس ( به عنوان مرحله حد واسط) منشأ می گیرند. تولید ساقه های نابجا به طور مستقیم بر روی ریشه، برگ و فلس های پیاز، یکی از روش های مرسوم تکثیر گیاهان است. در محیط کشت نیز این روش بویژه برای گیاهان علفی مناسب است. تشکیل اندام های نابجا به فعالیت مجدد ژن های مرتبط با فاز جنین زایی و نمو بستگی دارد (فارسی، ۱۳۸۴).
۱۵-۱- هدف از انجام این تحقیق
در میان گیاهان دارویی و معطر، زنیان گیاهی است که مطالعات و تحقیقات کمی بر روی آن انجام گرفته است. با توجه به اهمیت گیاه زنیان و لزوم شناخت روش های تکثیری آن و همچنین شناخت بهترین، سریع ترین و اقتصادی ترین روش تکثیر آن در شرایط درون شیشه ای، تحقیق حاضر به منظور شناسایی اثرات ژنوتیپ، تعیین بهترین ریزنمونه، بهترین ترکیب هورمونی و شرایط مناسب محیطی، جهت کشت درون شیشه ای زنیان و همچنین دانش فنی کشت درون شیشه ای آن در ایران انجام گرفته است. در این پژوهش، تکثیر این گیاه از طریق باززایی مستقیم با بهره گرفتن از بنزیل آمینو پورین (BAP) و ایندول استیک اسید (IAA) و تیدیازورون (TDZ) مورد بررسی و آزمایش قرار گرفته است.
فصل دوم
بررسی منابع علمی
۱-۲- ریزازدیادی
ریزازدیادی فرایند رشد رویشی و تکثیر از بافت یا دانه گیاهان می باشد که با بهره گرفتن از حداقل فضا و مکان، شرایط مناسبی را برای رشد گیاهان دارویی فراهم می کند. ریزازدیادی تکنیک مهمی است که در گیاهان دارویی به منظور تولید متابولیت های ثانویه ای که به طریقه شیمیایی نمی توان آنها را سنتز کرد، بکار برده می شود (Sidhu, 2010).
۲-۲- باززایی
گزارشات متعددی در ارتباط با باززایی مستقیم گیاهان وجود دارد که گیاهچه های جدید به طور مستقیم و بدون تشکیل کالوس، با بهره گرفتن از سطوح هورمونی مناسب در محیط کشت، تولید می شوند. در گیاهانی نظیر Hypericum spectabile (Akbas et al., 2011)، Ocimum gratissimum (Gopi et al., 2006)، باززایی مستقیم گزارش شده است. در گیاهانی نظیر Lactuca sativa (Mohebodini et al., 2011) وCuminum cyminum (Ebrahimie et al., 2003)، باززایی بعد از القای کالوس در محیط کشت با به کار بردن غلظت های هورمونی مناسب از سیتوکینین و اکسین، انجام شده است. برخی دیگر از گیاهان نیز از طریق القای جنین زایی سوماتیکی، باززایی می کنند. به این صورت که ابتدا در محیط حاوی غلظت بالای اکسین، تولید کالوس را تحریک کرده و سپس با انتقال توده کالوس به محیط فاقد اکسین یا دارای سطح کمتری از اکسین، شرایط را برای رشد جنین مهیا می کنند (Zimmerman, 1993). در گیاهان Trachyspermum ammi (Jasrai et al., 1992) و Saccaharum officinarum (Amirali et al., 2007) باززایی از طریق جنین زایی سوماتیکی گزارش شده است.
۳-۲- ریزازدیادی زنیان
تاکنون باززایی مستقیم زنیان در شرایط درون شیشه ای گزارش نشده است. فقط در خصوص باززایی زنیان از طریق جنین زایی سوماتیکی دو آزمایش انجام شده است. گزارش اول توسط Jasrai و همکاران (۱۹۹۲) به ثبت رسید که جنین زایی سوماتیکی با بهره گرفتن از ریزنمونه های هیپوکوتیل در محیط حاوی ۹ میکرومولار ۲,۴-D و ۳/۲ میکرومولار کینتین، بدست آمد. گزارش دوم نیز توسط Purohit و Kothar (2007) انجام شد که جنین زایی سوماتیکی زنیان با بهره گرفتن از ریزنمونه های کوتیلدون و گره کوتیلدون، در محیط حاوی ۲/۰ میلی گرم در لیتر ۲,۴-D انجام شد.
در ارتباط با موفقیت تولید گیاهان در شرایط درون شیشه ای، فاکتورهای زیادی مؤثر می باشد که می توان به موارد زیر اشاره نمود: ژنوتیپ، ریزنمونه، نوع، غلظت و تعادل هورمون ها، مکمل های رشد، اسیدهای آمینه و … به همین دلیل در گیاهان دارویی فاکتورهای متعددی به منظور بهینه سازی شرایط رشد و نمو بررسی می شود.
۴-۲- اثرات نوع ریزنمونه بر باززایی
در رازیانه (Fueniculum vulgare Miller.) از ریزنمونه های هیپوکوتیل (Anzidei et al., 2000) و دمبرگ (Miura et al., 1987)، در ‍زیره (Cuminum cyminum L.)، از ریزنمونه های برگ و هیپوکوتیل (Tawfikand and Noga, 2002)، در گل راعی (Hypericum perforatum) از قطعات برگ (Akbas et al., 2011)، و قطعات گره (Basila et al., 2010)، در درخت جوز سیلانی (Justicia prostrata) از قطعات گره (Jeyachandran et al., 2010)، در ریحان (Ocimum basilicum L.) از قطعات برگ (Ayabe and Sumi, 1998)، کوتیلدون، هیپوکوتیل و گره (اصغری، ۱۳۸۹)، و در گیاه دارویی بادرنجبویه (Melissa officinalis L.) از کوتیلدون، هیپوکوتیل، گره و مریستم انتهایی برای باززایی استفاده شده است (جنگجو، ۱۳۹۰). در تحقیقی که به منظور جنین زایی سوماتیکی گیاه دارویی زنیان (Trachyspermum ammi L.) صورت گرفته است، از دو نوع ریزنمونه کوتیلدون و گره کوتیلدونی استفاده شد که ریزنمونه کوتیلدون در محیط های ۲/۰ و ۵/۰ میلی گرم در لیتر ۲,۴-D با ۱۰۰ درصد القای جنین معرفی شد (Purohit and Kothari, 2007).