خاک (مزرعه ذرت)
بهشهر-ایران
LRC107
Leptinotarsa desemlineata (Say)
پرتغال
LRC137
Leptinotarsa desemlineata (Say)
کانادا
پنج محیط غذایی متفاوت دارای منابع متفاوت کربن و نیتروژن به شرح زیر برای انجام این تحقیق استفاده شد:
۱- محیط کشت کربن: نیتروزن (۳۵: ۱): شامل چهار درصد گلوکز و یک درصد پپتون
۲- محیط کشت کربن: نیتروزن (۱۰: ۱): شامل ۶/۰ درصد گلوکز و یک درصد پپتون
۳- محیط کشت OSM (دارای فشار اسمزی بالا): شامل هشت درصد گلوکز، دو درصد پپتون و ۵/۵ درصد کلرید پتاسیم
۴- محیط کشت فقیر از نظر مواد غذایی شامل دو درصد پپتون
۵- محیط کشت فقیر از نظر مواد غذایی شامل یک درصد عصارهی مخمر
عصارهی مخمر و پپتون دارای منابع متفاوت کربن و نیتروژن بوده و به ترتیب دارای نسبت کربن: نیتروژن ۶/۳: ۱ و ۸: ۱ میباشند (کاساس لوپز[۱۱۷]و همکاران، ۲۰۰۳). محیط کشت دارای فشار اسمزی بالا با ۵/۵ درصد آگار و بقیهی آنها با بهره گرفتن از یک درصد آگار تهیه شدند. بعد از تهیه محیطهای کشت در دمای ۱۲۱ درجه سلسیوس و فشار ۵/۱ اتمسفر به مدت ۲۰ دقیقه استریل شدند و بعد از خنک شدن آنها تا دمای حدود ۴۵-۵۰ درجه سلسیوس، ۱۸ میلیلیتر از آنها در فضای زیر هود آزمایشگاه به داخل هر کدام از پتریهای پلاستیکی با قطر ۸ سانتیمتر ریخته شد.
۳-۷- اندازه گیری میزان رشد قطری (رشد میسلیومی) کلونی
برای این منظور یک حلقه محیط کشت حاوی قارچ به قطر ۵ میلیمتر از محیط کشتهای مختلف دو هفتهای از هر کدام از جدایهها برداشته شد و در وسط هر یک از محیطهای کشت حاوی مواد غذایی مختلف قرار گرفت. اطراف هر تشتک پتری توسط پارافیلم پوشانده شد. تشتکهای پتری در انکوباتور با دمای ۱±۲۵ درجه سلسیوس و در شرایط تاریکی نگهداری شدند. هر جدایه دارای سه تکرار از هر محیط کشت بود. قطر رشدی کلونی در فواصل سه روزه و تا روز ۱۵ از پشت تشتک پتری بر حسب میلیمتر اندازه گیری گردید. اندازه گیری قطر کلونی در دو جهت عمود بر هم که بیشترین رشد قطری را داشتند انجام شد و میانگین آنها به عنوان رشد قطری کلنی ثبت شد (صفوی و همکاران، ۲۰۰۷).
۳-۸- اندازه گیری میزان اسپورزایی
برای تعیین میزان اسپورزایی هر جدایه روی هر کدام ازمحیطهای کشت، ابتدا یک حلقهی ۵ میلیمتری از بخش مرکزی هر کدام از جدایهها برداشته شد و حلقهی مورد نظر به داخل یک لوله آزمایشگاهی حاوی پنج میلیلیتر آب مقطر سترون و ۰۲/۰ درصد توین-۸۰ منتقل گردید و بعد از بستن درب لوله آزمایش توسط نوار پارافیلم به شدت به مدت ۵ دقیقه تکان داده شد تا اسپورها از روی محیط کشت جدا شده و به صورت سوسپانسیون درآیند. سپس تعداد کنیدیومها در سوسپانسیون به وسیله لام گلبول شمار یا هموسیتومتر برآورد شد (صفوی و همکاران، ۲۰۰۷).
۳-۹- آزمایش درصد جوانهزنی
برای تعیین درصد جوانهزنی اسپورها، ابتدا از قارچهای رشد کرده روی هر کدام از محیطهای کشت حاوی مواد غذایی مختلف، سوسپانسیون کنیدیومی به غلظت ۱۰۴ کنیدی در هر میلیلیتر تهیه گردید. سپس در سه نقطه از تشتک پتری حاوی محیطهای غذایی مختلف، و در هر محل یک قطره از سوسپانسیون کنیدیومی قرار داده شد و روی هر قطره یک عدد لامل سترون قرار داده شد. تشتکهای پتری به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور با دمای ۱±۲۵ درجه سلسیوس نگهداری شدند و سپس در زیر میکروسکوپ با بزرگنمایی ۴۰ برابر مورد بررسی قرار گرفتند. برای هر تیمار سه زمینه متفاوت میکروسکوپ و در هر زمینه تعداد ۱۰۰ عدد کنیدیوم بررسی گردید. کنیدیومهایی به عنوان جوانهزده محسوب گردید که طول لوله تندش در آنها مساوی یا بزرگتر از قطر خود کنیدیوم بود (صفوی و همکاران، ۲۰۰۷).
۳-۱۰- تعیین شدّت بیمارگری ماده تلقیح جدایههای قارچ B. bassiana
بیمارگری کنیدی حاصل از محیطهای متفاوت کشت از هر جدایه قارچی روی سوسک چهارنقطهای حبوبات (Callosobruchus maculatus L.) بررسی شد. این مرحله در سه تکرار و در هر تکرار با ۲۰ عدد حشره کامل انجام گرفت. حشرات مدّت ۲۰ ثانیه در داخل ۵ میلیلیتر از سوسپانسیون حاوی ۱۰۷ کنیدی در میلیلیتر غوطهور شدند و به داخل تشتکهای پلاستیکی حاوی یک کاغذ صافی مرطوب همراه ۲۰ گرم لوبیا چشم بلبلی قرار گرفتند. تشتکهای پتری حاوی حشرات تیمار شده در انکوباتور با دمای ۱±۲۵ درجه سلسیوس و با شرایط تاریکی نگهداری شدند و تعداد مرگ و میر حشرات به طور روزانه تا روز ۱۱ ثبت گردید. حشرات مرده از داخل تشتکهای پتری خارج شده و در داخل تشتکهای جدید حاوی کاغذ صافی مرطوب نگهداری شدند. در مواردی که رشد قارچی در سطح بدن حشرات مرده مشاهده گردید، مرگ آنها در اثر آلودگی قارچی محسوب گردید (کاسا و همکاران، ۲۰۰۲).
۳-۱۱- تجزیه و تحلیل داده ها
در تمامی آزمایشهای انجام شده از طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار استفاده شد. داده های مربوط به تلفات مرحله حشرات کامل سوسک چهارنقطهای حبوبات ابتدا با بهره گرفتن از فرمول arcsin√xتغییر شکل یافتند. تجزیه آماری داده ها با بهره گرفتن از نرمافزار IBM SPSS Statistics 16 انجام شد. برای محاسبه [LT50] جدایهها از آزمون LIFETEST در نرمافزار SAS Version 9.1.3 و برای مقایسه میانگینها از آزمون توکی در سطح احتمال آماری پنج درصد استفاده شد.
۴- نتایج
۴-۱- تأثیرنوع محیط کشت روی درصد جوانهزنی کنیدی قارچ Beauveria bassiana
نتایج حاصل از تجزیه آماری داده ها نشان داد که با اطمینان ۹۹ درصد بین میزان درصد جوانهزنی کنیدیوم جدایههای قارچ مورد نظر کشت شده درمحیطهای کشت مختلف در مدّت ۲۴ ساعت اختلاف معنادار وجود داشت. در مورد تأثیر محیطهای کشت، در سطح احتمال آماری یک درصد ۰۰۱/۰P< میباشد.
جدول ۴-۱- نتایج تجزیه واریانس داده های مربوط به تأثیر محیطهای متفاوت کشت روی درصد جوانهزنی جدایه B.bassiana DEBI007
منبع تغییرات
درجه آزادی
مجموع مربعات
میانگین مربعات
F
P
محیط کشت
۴
