۵۷٫۳
۵۶٫۳

۲۳۹
۱۷۲
۱۴۷
۱۲۶۲
۱۳۶۸
۱۰۰۰

واکنش های Real-time PCR با بهره گرفتن از دستگاه Applied Biosystems 7500 (آمریکا) و با روش ارزیابی بیان ژنی مطلق (absolute) انجام شد.
برای آشکارسازی تکثیر محصولات از رنگ فلورسنتی SYBR Green استفاده شد. برنامه و مواد واکنش در جدول۳-۵ و ۳-۶ آمده است.

کنترل منفی در هر آزمایش اضافه شد.
پرتو دهی (flourescent) در طول هر سیکل در پایان مرحله اتصال کنترل شد.
برای تایید اختصاصیت واکنش و مشخص کردن اندازه دقیق محصولات ،در پایان هر واکنش محصولات بر روی ژل الکتروفورز با شرایطی که قبلا توضیح داده شده برده شد.
علاوه بر آن منحنی ذوب (melting curve) برای مشخص شدن وجود آلودگی یا اتصالات پرایمر- دایمر در پایان واکنش انجام شد.
منحنی ذوب در بازه دمایی ۶۰-۹۵ درجه سانتی گراد و توقف ۳۰ ثانیه ای به ازای هر ۱ درصد افزایش دما انجام شد (جدول ۳-۶).
۳-۸-۳: کمیت سنجی مطلق(Absolute quantification):
در این روش با بهره گرفتن از رابطه خطی بین غلظت DNA و Ct های مربوط به یک سری رقت در قالب یک منحنی استاندارد، غلظت متناظر با هر Ct مشخص از روی معادله خط مربوط به منحنی استاندارد تعیین و به تعداد کپی مربوطه پی برده می شود.
۳-۸-۳-۱: انجام و تخلیص محصول PCR برای منحنی استاندارد
برای سنجش کمی مطلق تعداد کپی جایگاه cap در نمونه های Hib ، یک منحنی استاندارد توسط پرایمرهای (H, I, J) ساخته شد که در جدول ۳-۴ به آنها اشاره شده است. این استاندارد ها محصولات PCR مناطق هدف rpoB، IS1016 و جایگاه cap را پوشش می دهند که قبلا شرح داده شده است.
نمونه ها با هر یک از پرایمر های استاندارد به روش End-Point PCR و طبق برنامه شرح داده شده تکثیر شده و محصول آنها توسط کیت تخلیص محصول PCR ساخت شرکت Thermo scientific استخراج و تخلیص شد.
روش تخلیص:
تخلیص محصول PCR باعث جدا شدن پرایمرها، dNTP های اضافه، آنزیم ها و نمک ها از محصول شده و محصول کاملا خالص از قطعات سنتز شده مورد نظر به دست می دهد.
تخلیص محصول PCR با بهره گرفتن از GenJET PCR Purification Kit محصول شرکت Thermo scientific با کد شناسایی K0701 بدین شرح انجام شد.
µl – ۱۰۰ از بافر اتصال^[۶۱] به µl 100 از محصول PCR اضافه شده و مخلوط شد. پیدایش رنگ زرد در محلول نشان دهنده PH مناسب (۲/۵) برای اتصال DNA به بافر می باشد.
- محلول به درون ستون مخصوص تخلیص انتقال داده شده و به مدت ۶۰ ثانیه در rpm 1000 سانتریفیوژ شد. مایع عبور کرده از ستون دور ریخته شد.
- مقدارµl 700 از بافر شست و شو^[۶۲] که قبلا با نسبت ۱: ۵ با اتانول خالص رقیق شده است به ستون اضافه شده و به مدت ۶۰ ثانیه در rpm 10000 سانتریفیوژ شد. مایع عبور کرده از ستون دور ریخته شد.
- جهت خارج شدن کامل بافر شست شو یک بار دیگر به مدت ۶۰ ثانیه سانتریفیوژ شد.
- ستون به یک ویال ml 5/1 استریل منتقل شده و µl 50 از بافر جدا کننده^[۶۳] به مرکز پرده ستون اضافه شد. سپس به مدت ۶۰ ثانیه در rpm 10000 سانتریفیوژ شد.
- مایع خارج شده از ستون به عنوان محصول خالص PCR نگه داری و ستون مصرفی دور انداخته شد.
مراحل تخلیص محصول PCR برای سه جفت پرایمر H، Iو J انجام شد.
۳-۸-۳-۲: تهیه منحنی استاندارد
غلظت DNA های به دست آمده با بهره گرفتن از دستگاه نانودراپ ۲۰۰۰c در طول موج ۲۶۰ تعیین شده و غلظت های ۱۰nmol/l (100000 nmol/µl) از هر کدام ار DNA های تخلیص شده آماده شد.
نکته: ۱µg از DNA دو رشته ای که طول ۱kb دارد مساوی است با ۱٫۶۵ pmol یا به عبارتی۹۱/۹×۱۰^۱۱ مولکول.
یک سری رقت پنج تایی از ۱۰ تا ^۵-۱۰ از استانداردها با دو تکرار در هر غلظت، همراه با DNA آزمون در دستگاه قرار داده شد.
برنامه دمایی و غلظت مواد مورد استفاده در Real-time PCR در ادامه آورده شده است.
جدول۳-۵: مواد واکنش برای Real-time PCR

غلظت نهایی

حجم هر واکنش

مواد