بافر PCR (X10) lµ ۲ X 1
سولفات منیزیم (mmol25) lµ ۷/۰ mM 1
داکسی نوکلئوتید تری فسفات (mmol25) lµ ۳/۰ (از هر کدام) mM 2/0
آغازگر رو به جلو (pm10) lµ۵/۰ mµ ۴/۰
آغازگر رو به عقب (pm10) lµ۵/۰ mµ ۴/۰
آنزیم Taq پلیمراز (unit/µl5) lµ۳/۰ unit 5/0
فصل سوم
نتایج و بحث
شناسایی باکتری X.citri pv. citri (A*)
با توجه به تنوع بسیار زیاد موجود در بین سویههای مختلف مربوط به یک جنس باکتریایی مثل زانتوموناس، وجود روشی که بتوان با اطمینان یک پاتووار خاص را از بین کلکسیون باکتریایی یک مجموعه گزینش و مورد مطالعه قرار داد امری لازم و ضروری میباشد.
راهکارهای مختلفی جهت شناسایی با کتریها معرفی شده است، که در مورد زانتوموناس میتوان به روشهایی همچون، بررسی ویژگیهای فنوتیپی جدایهها شامل آزمون گرم در پتاس سه درصد (ساسلو و همکاران، ۱۹۸۲)، آزمون رشد هوازی / بیهوازی (شاد و همکاران، ۲۰۰۱)، آزمون القا واکنش فوق حساسیت در گوجه فرنگی (کلمنت و همکاران، ۱۹۶۴) و همچنین بررسیهای ژنوتیپی شامل ردیابی جدایهها با بهره گرفتن از آغازگرهای اختصاصی و مقایسه الگوی اثر انگشت ژنتیکی (کوپرو و گراهام، ۲۰۰۲)، (کولتا فیلهو و همکاران، ۲۰۰۶)، (پارک و همکاران، ۲۰۰۶)، میتوان اشاره نمود.
شناسایی به کمک تست بیماریزایی بر روی گیاه لیمو ترش
استفاده از روشهای فنوتیپی در شناسایی باکتری های مختلف بسیار پرکاربرد و موثر میباشد. این روشها همواره در تحقیقات مختلفی که به منظور شناسایی و تعیین هویت باکتری های مختلف انجام شده، مورد استفاده قرار گرفته است. در خصوص گونه های مختلف جنس زانتوموناس شناسایی مبتنی بر ویژگیهای بیوشیمیایی اهمیت زیادی نداشته و غالباً استفاده از روشهای مکمل توصیه شده است (واترین و همکاران، ۱۹۹۵)، نتایج حاصل از تزریق باکتری Xcc با ۳/۰=OD به پشت برگ گیاه لیموترش در این پژوهش با ظهور نقاط روشن و آبسوخته در محل تزریق بعد از ۳ تا ۴ روز پس از تزریق همراه بود، که به مرور تا هفتمین روز پس از تلقیح تشکیل لکههای جوش مانند کوچک، سفید و برجسته با هالهای آبسوخته و زردرنگ در سطح زیرین برگ لیمو تاییدی بر بیماریزایی سویهی مورد استفاده بود، که در ترادف با مطالعهی شرافتی و همکاران (۱۳۹۲) میباشد، که در همین راستا و با بهره گرفتن از روشی مشابه، این قابلیت را در باکتری مزبور بررسی کرده بودند.
آزمونهای فنوتیپی و بیوشیمیایی اگر چه از ملزومات اولیه شناسایی باکتری ها محسوب میشوند، اما به تنهایی برای تشخیص و شناسایی آنها کافی به نظر نمیرسند. انجام آزمون بیماریزایی با دشواریها و حساسیتهای مخصوص به خود همراه است که فراهم کردن شرایط بهینه رشد باکتری در گیاه مایه زنی شده برای بروز علایم بیماری یکی از آنهاست.
الف
ج
ب
شکل۱-۳- تست بیماریزایی روی لیمو
الف: کنترل، ب و ج: آلودگی با xcc
شناسایی به کمک آغازگرهای اختصاصی MS+/MS- و Xac01 / Xac02
روشهای ژنوتیپی مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلیمراز قادر به تشخیص و ردیابی کمترین میزان سلول باکتری در گیاه بیمار و مبتلا به شانکر میباشند (گل محمدی و همکاران، ۲۰۰۷)، که روش مناسبی برای گریز از مشکلات موجود در روشهای سنتی محسوب میشوند. در صورتی که روشهای ژنوتیپی مورد استفاده حساسیت و اختصاصیت مناسب داشته باشند، برای تایید نهایی اطلاعات حاصل از شناسایی نسبت به روشهای مورفولوژیکی و بیوشیمیایی، موثرتر هستند. در این پژوهش از دو جفت آغازگر اختصاصی برای شناسایی باکتری Xcc استفاده شد. کاربرد هر کدام از جفت آغازگرهای اختصاصی شاملMS+/MS- و Xac01 / Xac02 به ترتیب منجر به تکثیر قطعاتی ۵۸۱ و ۸۲۴ جفت بازی شد (شکل۲-۳)، در هر واکنش از DNA ژنومی Xcc سویه ۹۳۲۲-NIGEB بهعنوان کنترل مثبت استفاده شد که در قالب تیپ A باکتری زانتوموناس شناخته می شود. در واقع مشاهده ۲ باند مربوط به NIGEB-088 در مقابل تک باند مربوط به ۹۳۲۲-NIGEB در آزمون Multiplex PCR با آغازگرهای مذکور تایید کننده A* بودن ۰۸۸-NIGEB در مقابل ۹۳۲۲-NIGEB (تیپ A) میبود.
۵۸۱bp
۸۲۴bp
۳
۲
۱
L
شکل۲-۳- مربوط به تست (Xaco1 / Xaco2 / MS+/ MS-) Multiplex PCR
L: مارکر Kb1، ۱: کنترل منفی، ۲: NIGEB-088، ۳: ۹۳۲۲-NIGEB
استخراج دی.ان.آ ژنومی از باکتری X.citri pv. citri (A*)
بهطور کلی یک روش استخراج DNA خوب مستلزم فراهم آوردن محصولی با کیفیت و کمیت مطلوب میباشد، کیفیت بدین جهت که DNA استخراج شده عاری از آلودگیهای پروتئینی، نمکی و RNA باشد و کمیت نیز به غلظت قابل توجه نمونه استخراج شده اشاره دارد. روشی که در این پژوهش برای استخراج دی.ان.آ ژنومیک باکتری Xcc سویه NIGEB-088 استفاده شد، براساس روش فنل / کلروفورم + پروتئیناز K بود که در نهایت DNA استخراجی بر روی ژل آگارز ۱% بهصورت تک باند مشاهده شد.
L
۱
۱
شکل۳-۳- اکتروفورز DNA ژنومی استخراج شده بر روی ژل آگارز ۱% با ولتاژ ۹۰ به مدت ۴۵ دقیقه
L: مارکر Kb1، ۱: DNA ژنومی استخراج شده از سویهی NIGEB-088
تعیین کیفیت و کمیت DNA استخراج شده
دو پارامتر مذکور در مورد نمونه DNA استخراج شده از ژنوم باکتر ی Xcc با دو روش الکتروفورز بر روی ژل اگارز ۱% و همچنین روش اسکپتروفوتومتری مورد ارزیابی قرار گرفت، که در هر دو مورد نتایج مطلوبی مشاهده گردید. در روش اسپکتروفوتومتری میزان جذب نور در طول موجهای ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر قرائت و نسبت دو مورد حاصله نیز محاسبه شد. نسبت این دو عدد برای نمونه DNA استخراج شده بین ۸/۱-۲، (۸۷/۱) بود که نشان دهنده میزان خلوص بالا DNA ژنومی استخراج شده میباشد. همچنین نسبت جذبی (۸۷/۱) نشان دهنده عدم آلودگی پروتئینی و RNA در DNA ژنومی استخراج شده بود.
