در جوجه های جوان،اولین و شدیدترین آسیب از دست دادن فولیکول طبیعی زمینه ای می باشد. احتمالا چون بروس فابرسیسو در افزایش و انتخاب موجودی آنتی بادی های اساسی، آماده سازی برای ایجاد سلول هایی که IgM تولید می کنند و نقش قطعی در سوییچ پروتئین های وابسته به هم (مثل ایمنوگلوبولین ها) دارای اهمیت است، بهمین علت موجب افزایش و تشدید افزایش حساسیت ایجاد شده در جوجه های تلقیح شده با CIA شد.
جوجه هایی کهIBDV-CIA را در روز هچ دریافت کرده بودند به ویروس ILT که در سن ۴ هفتگی به آنها زده شد نسبت به گروه شاهد واکسینه شده با ILT مقاومت بیشتری نشان دادند.
پرندگان SPF تلقیح شده در سن دو هفتگی با CIA و یا IBDV مقاومت بیشتری علیه NDV، آبله طیور و ILT نسبت به گروهی که در روز هچ واکسینه شده بودند داشتند. رزنبرگر و کلود (۹۳) همچنین دریافتند که جوجه های گوشتی تجارتی که در معرض CIAو IBDV قرار گرفته بودند تیترهای آنتی بادی پایین تری در واکسیناسیون با NDV و IBDV نسبت به آنهایی که با CIA یا IBDV به تنهایی عفونی شده بودند داشتند. نشان داده شده است که CIA تخریب بورس ایجاد شده توسط IBDV را تقویت می کند. ویلسون و همکاران پیشنهاد کردند که سرکوب ایمنی ناشی از تغییرات پاتولوژیک بورس ممکن است در رابطه با تخریب زمینه بورس باشد که محیط لازم برای تمایز B-cellها را نابود می سازد.
در جوجه های جوان اولین و شدیدترین آسیب از دست دادن فولیکول طبیعی زمینه ای می باشد. احتمالا چون بورس فابرسیوس در افزایش و انتخاب موجودی آنتی بادی های اساسی، آماده سازی برای ایجاد سلول هایی که IgM تولید می کنند و نقش قطعی در سوییچ پروتئین های وابسته به هم (مثل ایمونوگلوبین ها) دارای اهمیت است، به همین علت موجب افزایش و تقویت سرکوب ایمنی می شود.
پیر و همکاران نشان دادند که مقادیر بالای آفلاتوکسین در جوجه ها موجب کاهش IgG می شود. (۸۳) مادرهای گوشتی که از آفلاتوسیکوزیس شدید کلینیکی رنج می برند، احتمالا مقادیر کمتری از IgG محافظت کننده به جوجه هایشان انتقال می دهد و میزان سرمی آن کاهش می یابد.
مایکوتوکسین های غذایی در غلظت های بالا ممکن است یک اثر مشابه داشته باشند. همچنین تریکوتسن و اوکراتوسین A برای طیور سرکوب کننده ایمنی می باشند.
۱-۱۱- ایمنی
۱-۱۱-۱- فعال
در جوجه های حساس یک روزه ای که با CIA تلقیح شدند، پاسخ آنتی بادی ضعیفی بوجود می آید، یعنی آنتی بادی های خنثی کننده تا سه هفته پس از تلقیح قابل شناسایی نیستند؛ حتی پس از آن تیترها پایین است (۸۰/۱) و تا هفته چهارم کمی افزایش می یابد. (۳۲۰/۱)، در حالی که پاسخ آنتی بادی در جوجه هایی که در سن ۶-۲ هفتگی بطور داخل عضلانی تلقیح شده بودند بطور قابل ملاحظه ای افزایش یافت که با خنثی سازی آنتی بادی های ضد CIA در روزهای ۷-۴ بعد از تلقیح قابل مشاهده بودند، ۱۴-۱۲ روز پس از تلقیح حداکثر تیترها (۵۱۲۰/۱ – ۱۲۸۰/۱) ایجاد شد. اگر جوجه ها به جای تلقیح عضلانی، از راه دهان (Oral) آلوده شوند، تشکیل آنتی بادی های خونی حدود یک هفته به تأخیر می افتد. یوآسا و همکارانش گزارش کرده اند که افزایش تولید آنتی بادی درست در زمانی که غلظت ویروسی در بافت های جوجه کاهش یافته است، می باشد. هنوز اطلاعاتی راجع به ایمنی سلولی در برابر CIA به دست نیامده است.
جوجه ها در تمام سنین به عفونت حساس هستند اما حساسیت به CIA از طریق راه های طبیعی ابتلا بعد از سن دو هفتگی به سرعت در جوجه هایی که نقص ایمنی ندارند، کاهش می یابد. آلودگی همزمان با ویروس بیمار عفونت بورس فابرسیوس و یا پرندگانی که بورس فابرسیوس آنها را برداشته اند باعث به تاخیر افتادن ایجاد مقاومت سنی می گردد. جوجه هایی که در دوران جنینی بورسشان برداشته شده بود، وقتی در سنین ۲۱ یا ۳۸ روزگی با CIA عفونی شدند، علائم مشخصه کم خونی عفونی جوجه ها را نشان دادند که در هر دومورد ۱۴ روز پس از تلقیح، مقادیر هماتوکریت جوجه ها کم بود و درصد سلول های CD4+ و CD8+ تیموس ۲۱ روز پس از تلقیح به طرو قابل ملاحظه ای کاهش یافته بود. در صورتی که در جوجه های سالمی که عفونی شده بودند، هرگز میزان هماتوکریت کاهش نیافت. این مطالب این فرضیه را که مقاومت سنی به CIA وابسته به آنتی بادی است و مربوط به از بین رفتن سلول های هدف CIA نمی باشد را تقویت می کند و نیز این داده ها بیان می کنند که سلول های CD4+/CD8+ هدف عفونت هستند. (۵۱)
۱-۱۱-۲- غیرفعال
آنتی بادی های مادری در محافظت جوجه های زیر دو هفته در برابر عفونت CIA دارای اهمیت می باشند و مانع به مخاطره افتادن ایمنی جوجه ها به وسیله سایر فاکتورها می گردد.
شیوع کم خونی در سطح گله در حقیقت با عدم حضور آنتی بادی ضد CIA در گله های مادر آنها مربوط می شود. آنتی بادی مادری جوجه هایی که از مادران ایمن با تیتر آنتی بادی VN 640-160 به دنیا آمده اند فقط تا سن دو هفتگی این آنتی بادی ها را نشان می دهند.
۱-۱۲- تشخیص
۱-۱۲-۱- جداسازی و شناسایی عامل مولد
عامل کم خونی جوجه ها را می توان از تمام بافت های جوجه های مبتلا جدا نمود. در جوجه هایی که در سن یک روزگی تلقیح شده اند، ۷ روز پس از عفونت حداکثر تیتر ویروسی قابل مشاهده است. عامل کم خونی در بافت ها و مدفوع تقریبا به طور دائم تا ۲۱ روز حضور دارد و پس از آن به سرعت کاهش می یابد اما پس از ۱۴ روز سرم آلودگی خود را از دست می دهد. بولو دریافت که عفونت خون کامل کمتر از ۱۴ روز طول می کشد.
جوجه هایی که در سن ۶-۴ هفتگی تلقیح شده اند اگرچه حداکثر تیتر ویروسی را در بافت های مختلف و مدفوع ۷ روز پس از عفونت نشان می دهند ولی در عرض ۲۱-۱۴ روز به سرعت تا مقادیر پایین تر کاهش می یابد و نکته دیگر اینکه عامل کم خونی جوجه ها هرگز در مغز یا سرم این پرندگان نشان داده نشده است. کبد را به عنوان مخزن عامل کم خونی جوجه ها عنوان کرده اند چون پیوسته مقادیر بالایی از عامل را در خود دارد. برای حذف یا غیرفعال کردن آلودگی های احتمالی قبل از تلقیح در کشت سلولی می توان کبد هموژنیزه شده را به مدت ۵ دقیقه در ۷۰ درجه سانتی گراد حرارت داد یا اینکه داخل کلروفرم قرار داده شود. تلقیح داخل عضلانی یا داخل صفاقی جوجه های حساس یکروزه اختصاصی ترین روش در دسترس برای جداسازی اولیه CIA می باشد، اما در این حالت عفونت زایی ۱۰۰ برابر کمتر از کشت سلولی است که می توان بوسیله تضعیف ایمنی جوجه های آزمایشگاهی میزان عفونت زایی را افزایش داد.
۱۶-۱۴ روز پس از تلقیح جوجه ها ربرای مشاهده کم خونی آزمایش می کنند که با مقادیر هماتوکریت زیر ۲۷ % مشخص می شوند. ضایعات ماکروسکوپیک حتی ممکن است در پرندگانی که کم خون نیستند نیز مشاهده شود. می توان آزمایشات آسیب شناسی بافتی از بافت های مشکوک به عمل آورد ولی این کار همیشه برای تشخیص قطعی لازم نمی باشد. از کشت سلولی نیز می توان برای جداسازی عامل مولد در محیط آزمایشگاه استفاده کرد. محیط کشت هایی که تازه درست شده اند (۱۰۵x 3-2 سلول در هر سی سی در محیط کشت RPMI1640cm2/105) باید به وسیله ۱۰/۱ حجم خود از رقت ۲۰/۱ یا بیشتر و یا رقت های متوالی ۱۰ برابر از بافتهای مخصوص هموژنیزه تلقیح شوند. ضایعات شلولی پس از ۶-۱ بار کشت مجدد (۲۴-۷ روز) دلالت بر عفونت CIA می کند اما هیچ شکل خاصی از ضایعات سلولی که بتوان به وسیله میکروسکوپ نوری تشخیص داد وجود ندارد چون وقت گیر و گران است و به علاوه جداسازی عامل کم خونی عفونی جوجه ها باید توسط سرولوژی قطعی گردد.
۱-۱۲-۲ -سرولوژی
آنتی بادی ضد CIA در سرم جوجه ها یا کیسه زرده را می تواند به وسیله خنثی سازی ویروس VM (8،۱۲۴) یا تست فلورسانس آنتی بادی غیرمستقیم مشاهده کرد.
- VN (Virus Neutralization)
برای تست خنثی سازی ویروس، رقت های دوبرابر متوالی سرم را با هم حجم آن از سوسپانسیون CIAمخلوط می کنیم. (TCID50 ۵۰۰-۲۰۰) و این مخلوط را در گرماخنه ۳۷ درجه سانتی گرادی وارد می سازیم. این مراحل ممکن است ۵ هفته طول بکشد زیرا گاهی ۹ کشت متوالی لازم است تا تیتر آنتی بادی های سرم مورد ارزیابی قرار گیرد. در تست خنثی سازی رقت ثابت سرم ۸۰/۱ -۲۰/۱ با هم حجم آن از سوسپانسیون CIA با حدود TCID50 ۵/۱۰۵ مخلوط شد. با این روش عدم حضور آنتی بادی ضد CIA در سرم های مورد آزمایش پس از یک یا دو کشت متوالی و حضور آنتی بادی پس از ۳ یا ۴ کشت متوالی از سلول های تلقیح شده ردیابی می شوند. تیتر آنتی بادی های مربوطه را می توان به وسیله تعداد کشت های مجددی که سلول های تلقیح شده زنده ماندند تخمین زد. گاهی ممکن است سرم جوجه ها، حتی اگر تا ۵۰/۱ یا ۸۰/۱ رقیق شوند، اثر سمی روی سلول های محیط کشت MSB1 نشان دهند. بنابراین برای جلوگیری از پاسخ منفی کاذب لازم است سرم ها کنترل گردند.
- IFA (Indirect Fluorescent Antibody)
برای IFA، سلولهای MSB1 آلوده به CIAرا دست قبل از شروع لیز سلول ها یعنی ۴۲-۳۶ ساعت پس از تلقیح جمع آوری می کنند. سپس این سلول ها را روی لام های شیشه ای قرار داده و با استن فیکس می کنند و به عنوان آنتی ژن مورد استفاده قرار می دهند. سلول ها ابتدا تحت تأثیر سرم مورد آزمایش قرار می گیرند وسپس به وسیله آنتی سرم ضدگاماگلوبولین جوجه ها تهیه شده روی پستانداران که در فلورسئین تثبیت شده تحت تأثیر قرار می گیرند. دیدن گرانول های کوچک بدون شکل منظم در هسته سلول های بزرگ شده با رنگ آمیزی فلورسنت به عنوان دلیلی بر وجود آنتی بادی در سرم در نظر گرفته می شود. کنترل مثبت باید موجود بوده و حاوی این اشکال باشد ولی کنترل منفی استفاده چندانی ندارد.
تست IFA حساسیت و ویژگی کمتری نسبت به تست VN دارد (۱۵) اما تست VN دشوارتر بوده و مدت زیادی طول می کشد تا نتیجه به دست آید.
- IIP (Indirect Immunoperoxidase test)
تکنیک رنگ آمیزی ایمونوپراکسیداز غیرمستقیم بر اساس تشکیل سوبسترای غیرمحلول است که موجب قابل رویت شدن آنتی ژن یا آنتی بادی ها در سطح سلولار یا ساب سلولار می شود.
در این روش یک سوسپانسیون از سلول های MDCC-MSB1 شامل cc/ سلول ۱۰۵x 5/2 با سویه CL1 از CIA عفونی شده و مخلوط ویروس+ سلول در شرایط Co2 ۷۰ % و حررارت ۴۱ درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری می شود. پس از ۴۸-۳۶ ساعت، ۵۰-۳۰ % سلول ها CPE ناشی از عفونت CIA را نشان می دهد.یک کنترل شامل سلو های MDCC-MSB1 غیرآلوده هم تهیه می شود. سپس سوسپانسیون سلولی به مدت ده دقیقه در ۱۰۰۰ حرکت انتقالی در دقیقه به صورت توده های سلولی آهسته خالی می شوند.
هر توده سلولی دوباره با cc10 PBS مخلوط شده و داخل هر گوده از ۹۶ گوده ظروف کشت بافت ریخته می شود. (cc 0.1 در هر گوده( گوده ها قبلا با cc 0.1 از پلی-ال-لیزین mg/ml 1 به مدت ۳ ساعت در ۲۲ درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری می شوند. س از گرمخانه گذاری، سلول ها مستقیما با اضافه کردن cc 0.1 استن سرد ۴۰ % فیکس می شوند و به مدت ۲۰ دقیقه در ۴ درجه سانتی گراد قرار می گیرند. رطوبت پلیت ها را گرفته و بعد در معرض هوا خشک می کنند و یک شب در گرمخانه ۳۷ درجه سانتی گرادی گذاشته و سپس تا زمان مصرف در ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری می کنند.
سرم کنترل و آزمایش به نسبت ۱۰۰/۱ در بافر رقیق کننده آنتی بادی رقیق می شوند و به میزان ۵۰ میکرولیتر به گوده هایی که حاوی سلول های سالم و آلوده به CIA فیکس شده هستند، اضافه می شوند. پس از یک ساعت، گوده ها را خشک کرده و سه بار به مدت ۳ دقیقه با PBS حاوی ۰.۵ % تواین ۲۰ شسته می شود. سپس گوده ها را با cc 0.05 سرم ضد IgG جوجه تهیه شده روی بز کانژوگه شده در μg/ml 5 پراکسید از هورس ردیش وارد عمل می شود. پس از یک ساعت گرمخانه گذاری پلیت خشک شده و گوده ها مثل بالا سه بار شسته می شوند. باند شدن آنتی بادی به وسیله اضافه کردن cc 0.1 از سوبسترای پراکسیداز یعنی ۳-آمینو ۹-اتیل کاربازول قابل رویت می شود. اجزاء سوبسترا با حل کردن جداگانه ۰.۰۲ % ۳آمینو۹اتیل کاربازول و ۰.۰۲ % H2O2 اوره در ۹۵ % الکل اتیلیک فراهم می شود.سوبسترای مورد مصرف قبل از شروع کار با مخلوط کردن به نسبت ۱/۱ اجزاء تهیه می شود. پلیت های مورد آزمایش ۲۰-۱۰ دقیقه در ۲۲ درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری شده و واکنش با سه بار شستشو با محلول PBS متوقف می شود.
در یک مطالعه سه تست ELISA، IIP و IFA از نظر ردیابی آنتی بادی ضد CIA با هم مقایسه شدند. نتایج ممقایسه ای این سه روش روی ۱۸۵ نمونه سرم جوجه های بیمار در ۸۴ % موارد تطابق داشت اما در IFA و IIP به نسبت ELISA تست های کمتری مثبت شد. تطابق IFA و IIP در ۹۳ % موارد در مقایسه با تطابق ۹۱ درصدی بین IIP و ELISA با تطابق ۸۴ % IFA و ELISA مشخص شد.
تعداد نمونه های سرم | IFA | IIP | ELISA |
۱۰۸ ۴۷ ۱۳ ۰ ۱۷ |
+ - + - - |
+ - - |