P6: AGAGAGAGAGAGAGAGG
P7: CTCTCTCTCTCTCTCTT
P8: GCA CAT GCA R (TG)7
P9: GACAGACAGACAGACA
P10: AGCAGCAGCAGCAGCAGC
۱۵ میکرولیتر مخلوط واکنش شامل ۵/۱ میکرولیتر dNTPs، ۵/۱ میکرولیتر بافر PCR، ۲/۰ میکرولیتر آنزیم Taq پلیمراز، ۴/۰ میکرولیتر MgCl2، ۱ میکرولیتر آغازگر و ۸/۱ میکرولیتر DNA ژنومی و ۶/۸ میکرولیتر آب دوبار تقطیر شده (جدول ۳-۲) پس از آماده سازی در دستگاه واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (شکل ۳-۸) قرار داده می‌شود. برنامه دستگاه به صورت زیر می‌باشد:
۲ دقیقه در دمای ۹۴ درجه سلیسیوس
۳۰ ثانیه در دمای ۹۴ درجه سلیسیوس
۴۵ ثانیه در دمای ۴۵ تا ۵۲ درجه سلیسیوس (بسته به آغازگر مورد استفاده)
۲ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سلیسیوس
تعداد چرخه‌ها ۴۵ می‌باشد و جهت تکمیل سنتز DNA چرخه انتهایی به مدت ۱۰ دقیقه و دمای ۷۲ درجه سلیسیوس صورت می‌گیرد (شکل ۳-۷).
جدول ۳-۲ مواد واکنش، حجم و غلظت نهایی اجزای واکنش زنجیره پلیمراز
| مواد واکنش | حجم ماده (میکرولیتر) |
| DDW ۱۰X PCR Buffer Mgcl2 (۵۰ mM) dNTPs (10 mM) Taq DNA Polymerase (5u/µl) DNA(20 ng/µl) Primer Total |
۶/۸ ۵/۱ ۴/۰ ۵/۱ ۲/۰ ۸/۱ ۱ ۱۵ |
شکل ۳-۷: برنامه واکنش زنجیره‌ای پلیمراز
شکل ۳-۸: دستگاه‌های PCR مورد استفاده در این آزمایشات
۳-۵- الکتروفورز محصول PCR روی ژل آگارز
الکتروفورز محصول PCR روی ژل آگارز ۵/۱ درصد Topvision® صورت گرفت. ۷ میکرولیتر از هر یک از محصولات واکنش به مدت ۳ الی ۴ ساعت بر روی ژل ۲ درصد آگارز در تانک الکتروفورز افقی (پایا پژوهش پارس) در توان ۷۰ وات اجرا شد. در انتهای ردیف چاهک از یک مارکر ۱۰۰ یا ۵۰ جفت بازی استفاده شد. پس از ساعت مورد نظر از ژل تصویربرداری شد.
شکل ۳-۹: تانک الکتروفورز ژل آگارز مورد استفاده در این آزمایشات
شکل ۳-۱۰: دستگاه BioDoc Analyzer و سیستم تصویربرداری از ژل آگارز
۳-۶- نمره دهی باندهای مشاهده شده روی آگارز نشانگر غالب ISSR
نشانگر ISSR نشانگر غالب بوده و وجود باند با ۱ و عدم وجود باند با صفر نمره‌دهی می‌شود برای مثال در شکل زیر ۱ دارای لوکوس‌های A، B و C دارای باند بوده و نمره ۱ و لوکوس‌های B و E وجود نداشته و فاقد باند بوده لذا نمره صفر دریافت می‌کنند (شکل ۳-۱۱).
شکل ۳-۱۱: باندهای موجود و نمره‌دهی لوکوس‌های موجود حاصل از تصویربرداری ژل‌های آگارز نشانگر ISSR
۳-۷- ورود داده‌های حاصل از ژل‌ها به نرم افزار اکسل جهت بررسی تعداد باندهای تک‌شکل و چندشکل، اختصاصی[۶۴]، ثابت[۶۵] و اختصاصی ثابت[۶۶]
شکل ۳-۱۲: ورود داده‌های حاصل از نمره‌دهی ژل‌های آگارز به نرم افزار اکسل جهت آنالیز
پس از ورود داده‌ها به صورت ۰ و ۱ چنانچه در جایگاهی تمام نژادها شماره ۱ را داشته باشند آن جایگاه یا باند تک‌شکل قلمداد می‌شود مانند P1L4 و P2L6 و اگر فرد یا افرادی فاقد این جایگاه باشند نمره صفر را اخذ نموده و این جایگاه چندشکل محسوب می‌گردد مانند P1L1 و P3L1 (شکل ۳-۱۲).
شاخص‌های زیر برای هر آغازگر مورد استفاده محاسبه شد:
میزان چندشکلی نشانگر
قدرت حل
نسبت چندگانه موثر
شاخص نشانگری
محتوای اطلاعات چندشکلی نشانگر[۶۷] (معادله ۳-۱) با بهره گرفتن از جمع مربع فراوانی آللی و حذف جایگاه ژنی تک‌شکل با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه شد (Anderson et al., 1993).
