۱- Stock solution
۱-۲-۳- محلول های ذخیره مواد معدنی محیط کشت MS
محلول های ذخیره شامل محلول های ذخیره نیترات، محلول ذخیره سولفات، محلول ذخیره PBMO¹ (فسفر، بر و مولیبدن)، محلول ذخیره آهن و محلول هالوژن با غلظت ۵۰ برابر غلظت های نهایی محیط کشت تهیه شد و به مقدار ۲۰ میلی لیتر از هر محلول ذخیره برای تهیه ۱۰۰۰ میلی لیتر محیط کشت استفاده شدند (جدول ۱-۳). محلول ذخیره آهن (NaFeEDTA) بایستی در مقابل نور محافظت شود، بنابراین لازم بود پس از تهیه در یک شیشه تیره نگهداری شود.

جدول ۱-۳: ترکیب محلول های ذخیره (۵۰×) پنج نمک غیر آلی در فرمولاسیون موراشیگ و اسکوگ (MS)

KNO₃ ۱۹۰ H₃ BO₃ ۶۲/۰
محلول ذخیره سولفات محلول ذخیره NaFeEDTA
MgSO₄.7H₂ O 37 FeSO₄.7H₂ O 4/784
MnSO₄.H₂ O 1/69 Na₂ EDTA 3/724
ZnSO₄ .۷H₂ O 86/0
CuSO₄ .۵H₂ O 0025/0
۱- KH₂ PO₄ +H₃ BO₃ +Na₂ MoO₄ .۲H₂ O
۳-۳- محلول های ذخیره هورمون
برای تهیه محلول ذخیره ۱۰۰ میلی گرم در لیتر BAP و IAA، ابتدا مقدار ۱۰۰ میلی گرم BAP و ۱۰۰ میلی گرم IAA را وزن کرده و در محلول یک نرمال NaOH حل گردید و حجم آنها به ۱۰۰ میلی لیتر رسانده شد. محلول های ذخیره را می توان به مدت چند ماه در یخچال نگهداری نمود. این محلول ها در طولانی مدت در اثر واکنش های فتوشیمیایی از بین می روند. هورمون BAP قبل از اتوکلاو کردن به محیط کشت اضافه می شود چون این هورمون در برابر گرما مقاوم است و طی اتوکلاو شدن تجزیه نمی شود ولی هورمون IAA، بعد از اتوکلاو و زیر هود به محیط کشت اضافه می گردد.
۴-۳- سایر مواد
بعضی از مواد از قبیل ساکارز و آگار و میواینوزیتول، که با مقادیر زیاد مورد استفاده قرار می گیرند هنگام تهیه محیط کشت بطور مستقیم وزن شده و به محیط کشت اضافه شد. ساکارز به مقدار ۳۰ گرم در لیتر و آگار به مقدار ۸ گرم در لیتر به عنوان عامل ژلاتینی کننده و میواینوزیتول به مقدار ۱۰۰ میلی گرم در لیتر مورد استفاده قرار می گیرند.
۵-۳- ضدعفونی نمودن نمونه ها
به دلیل بروز برخی آلودگی های قارچی و باکتریایی در آزمایشات کشت بافت، از هیپوکلریت (NaClO) و الکل جهت استریلیزاسیون و ضدعفونی بذور استفاده گردید. از الکل اتانول ۷۰ درصد به مدت ۱ دقیقه و هیپوکلریت سدیم در غلظت ۵/۲ درصد به مدت ۱۰ دقیقه استفاده شد.
۶-۳- کشت بذور و شرایط نگهداری و رشد
پس از کشت بذور در شیشه، اطراف درب شیشه ها توسط پارافیلم بسته شد و در اتاقک رشد با شرایط دمای روز ۲±۲۷ و دمای شب ۲±۲۲ درجه سانتیگراد، نور سفید فلورسنت و فتوپریود ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی با شدت نور ۳۰۰۰ لوکس قرار گرفتند.
۷-۳- آزمایشات
این پژوهش در سه آزمایش جداگانه صورت گرفت.
۱-۷-۳- آزمایش اول: بررسی اثرات نوع ترکیبات هورمونی بر باززایی درون شیشه ای زنیان
این آزمایش به منظور بررسی تأثیر تنظیم کننده های رشد گیاهی بر میزان باززایی ریزنمونه نوک شاخه از توده ارومیه، در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام گردید. فاکتورهای آزمایشی شامل ترکیب هورمون BAP در ۴ سطح (صفر، ۲/۲، ۴/۴ و ۸/۸ میکرومولار) و هورمون IAA در ۴ سطح (صفر، ۵/۰، ۱/۱ و ۲/۲ میکرومولار) بودند. پس از گذشت ۹ هفته و پایان ۳ بار واکشت، درصد و میانگین باززایی در هر تیمار یادداشت گردید.
۲-۷-۳- آزمایش دوم: بررسی اثرات ریزنمونه بر باززایی درون شیشه ای گیاه زنیان
این آزمایش به منظور انتخاب بهترین نوع ریزنمونه با ژنوتیپ ارومیه انجام گردید. آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح آماری کاملاً تصادفی با دو فاکتور A نوع ریزنمونه در ۴ سطح (نوک شاخه، گره، کوتیلدون و هیپوکوتیل) و B تیمار هورمونی شامل BAP (صفر و ۴/۴ و ۸/ ۸ میکرومولار) و IAA (5/0، ۱/۱و ۲/۲ میکرومولار) در سه تکرار انجام شد و پس از گذشت ۹ هفته و انجام ۳ بار واکشت، درصد و میانگین باززایی مستقیم در هر ریزنمونه شمارش گردید.
۳-۷-۳- آزمایش سوم: بررسی اثر ژنوتیپ های مختلف بر میزان باززایی درون شیشه ای زنیان
این آزمایش به منظور بررسی اثر ژنوتیپ بر میزان باززایی ریزنمونه نوک شاخه با بهره گرفتن از ژنوتیپ های مختلف به صورت فاکتوریل در قالب طرح آماری کاملاً تصادفی با دو فاکتور A نوع ژنوتیپ در سه سطح ( توده های مشهد، اصفهان و ارومیه) و B نوع محیط هورمونی در چهار سطح ( غلظت های ۴/۴ و ۸/۸ میکرومولار BAP و غلظت های ۴/۴ و ۸/۸ میکرومولار TDZ در محیط کشت MS) به همراه هورمون IAA (5/0 میکرومولار) در سه تکرار انجام گردید. پس از ۹ هفته و پایان ۳ بار واکشت، حداکثر درصد و میانگین باززایی در هر تیمار یادداشت گردید.
۸-۳- ریشه زایی
این آزمایش به منظور بررسی اثر هورمون IBA و IAA و نوع محیط پایه بر میزان ریشه زایی گیاهچه های باززا شده در آزمایشگاه انجام گرفت. تیمارهای آزمایشی شامل محیط ۱/۲MS حاوی هورمون IBA (5/0 و ۱ میلی گرم در لیتر) و IAA (5/0 و ۱ میلی گرم در لیتر) و محیط MS حاوی هورمون IBA (5/0و ۱ میلی گرم در لیتر) و IAA (5/0 و ۱ میلی گرم در لیتر) بودند. آزمایش به صورت طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار صورت پذیرفت. در پایان واکشت ها، درصد ریشه زایی و طول ریشه های حاصله اندازه گیری گردید.
۹-۳- سازگاری
به منظور استقرار گیاهچه های ریشه دار شده از مرحله باززایی، از محیط پرلیت استریل شده استفاده گردید. گیاهچه ها بعد از واکشت های مکرر و رشد مناسب به محیط پرلیت در داخل لیوان های پلاستیکی و سپس به منظور حفظ رطوبت به داخل جعبه های پلاستیکی انتقال داده شدند. برای آبیاری گیاهچه های سازگار شده از محلول ۱/۲MS استفاده شد. سازگاری به تدریج و طی دو هفته صورت گرفت. گیاهچه ها پس از سازگاری، به شرایط گلخانه انتقال یافتند.
۱۰-۳- تجزیه و تحلیل آماری داده ها و نرم افزارهای مورد استفاده
داده های حاصل از آزمایش با بهره گرفتن از نرم افزار کامپیوتریSAS 9.1 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و داده هایی که نرمال نبودند توسط روش تبدیل زاویه ای (Arc sin√x +0.5) نرمال شدند و برای رسم نمودارها از نرم افزار Excel استفاده شد و برای مقایسه میانگین از آزمون دانکن^۱(DMRT) استفاده گردید.